بیوسنتزی می¬باشند و این بزرگترین محدودیت در انجام مهندسی متابولیت ها می¬باشد. بنابراین نقشه¬یابی مسیرهای بیوسنتزی پیش¬نیاز هر برنامه مهندسی متابولیت می¬باشد. پس از شناخت مسیر، مرحله بعدی شناسایی آنزیم¬های کلیدی در مسیر بیوسنتزی می¬باشد. تحقیقات بر روی بیوسنتز آلکالوئیدها در پروانش منجر به شناسایی ژن¬های تنظیمی گردید. همچنین در خشخاش ) P. somniferum (مطالعات منجر به شناسایی مسیرهای سنتزی مرفین گردید. این مطالعات آشکار ساخت که در حدود 17 مسیر آنزیمی، پیش¬ماده تیروزین را به محصول نهایی مرفین کاتالیز می¬کنند و چندین آنزیم نیز در این مسیر شناسایی و کلون گردیدند (Kutchan و همکاران، 1998). بنابراین گیاهان دستوزری ¬شده یا مهندسی شده ژنتیکی می-توانند به عنوان بیورآکتورهای سبز، جهت تولید ترکیبات شیمیایی با ارزش مورد استفاده قرارگیرند (Satio وهمکاران، 1992). راهکارهای جهت افزایش متابولیت ها توسط دستورزی ژنتیکی شامل موارد زیر است:
1- تولید فوق¬العاده پیش¬ماده¬های متابولیت¬های ثانویه
2- تولید فوق¬العاده محصول ژن
3- ایجاد یک شاخه جدید جهت مسیر از پیش موجود
4- تنظیم پایین دستی واکنش موجود با استفاده از روش آنتی¬سنس
5- دستورزی ژن¬های تنظیمی که محصولات آنها با اتصال بهDNA به عنوان فعال¬کننده¬ یا بازدارنده رونویسی عمل می¬کنند
6- انتخاب موتانت¬های تنظیمی با بیان افزایش ¬یافته مستقل از بافت
7- در برخی مواقع بیان اختصاصی بافت توسط پروموتورهای مناسب جهت تولید هدفمند متابولیت لازم است.

1-5- گیاه شناسی خشخاش ایرانی (Papaver bracteatum)
خشخاش ایرانی با نام علمی Papaver bracteatum از گونه های بومی ایران و متعلق به خانواده خشخاش است. گیاهان خانواده خشخاش عموماً علفی، به ندرت دارای اعضای چوبی و یا به صورت درختچه هستند. غالب گیاهان این خانواده مانند جنس Papaver مجاری ترشحی لاتکس، مرکب از سلول های منفرد یا پشت سر هم با جدار عرضی سوراخ دار و یا به صورت مشبک دارند. این سلول¬ها و مجاری، در پارانشیم ها مخصوصاً در بافت آبکش دیده می شوند. شیرابه آنها درجنس Papaver شیری رنگ است. P. bracteatum به طور طبیعی در مناطق با ارتفاع 1500 تا 2500 متری از سطح دریا گسترش دارد. این گونه در رشته کوه¬های البرز در شمال و در کردستان ایران می¬روید (زرگری، 1368).

P. bracteatum گیاهی است علفی و چند ساله که تا 120 سانتی متر طول دارد؛ دمگل ها به قطر 4-3 میلی¬متر می باشد. برگ ها در هر گره 6-5 عدد؛ برگ و ساقه پوشیده از تار و گل ها درشت و بسیار زیبا هستند(شکل 1-1). 3 تا 8 گلبرگ دارد. گلبرگ¬ها مایل به ارغوانی، که در قاعده آنها یک لکه درشت تیره رنگ دیده می شود (شکل 2-1). در زیر گلبرگ¬های شکفته P. bracteatum، براکته¬هائی به جای کاسبرگ¬ها دیده می شود. میوه آن کپسول تخم مرغی و کروی با 20-14 عدد کلاله می باشد که از کپسول نارس آن پس از تیغ زدن، شیرابه ای با بوی قوی خارج می گردد. ریشه، برگ و کپسول دارای مقادیر زیادی تبائین است. این گیاه در طول زمستان حالت روزتی داشته و برگ¬های بلندی دارد، در بهار زمانی که برگ¬هایش کاملا توسعه یافت، ساقه ای گل دهنده و بلند به طول پنجاه تا هشتاد سانتیمتر ایجاد می شود. این گیاهان معمولا گلدهی را در سال دوم رشد آغاز می کنند و سه تا پنج گل می دهند. در فصل گلدهی تا 25 گل در هر گیاه ممکن است تولید شود. میوه شامل کپسولی خشک به طول سه سانتیمتر و وزن دو گرم است که توسط صفحه ای دربالا پوشیده می شود. در زمان رسیدگی این صفحه از کپسول فاصله گرفته و بذرها از میان منفذ ایجاد شده پخش می گردند. پس از رسیدگی کپسول¬ها، بخش¬های هوایی خشک شده و گیاه به حالت خواب در طول تابستان باقی می ماند تا زمانی که دوره رشد رویشی جدید در زمستان بعدی آغاز شود. این گیاه دگر گشن بوده و دارای خودناسازگاری گامتوفیتی می باشد (زرگری، 1368).

شکل 1-1- گیاه Papaver bracteatum الف) در زمان گلدهی؛ ب) در زمان تشکیل غوزه (کپسول)
Milo و همکاران (1998) اظهار داشتند که گونه P. bracteatum می تواند به عنوان جایگزین مناسب برای تولید کدئین باشد، زیرا میزان بالایی تبائین دارد (تبائین پیش ماده کدئین است که می تواند به آسانی در صنعت داروسازی به کدئین تبدیل شود). تبائین همچنین به عنوان ماده خام برای تولید داروهایی چون اکسی کدون، نالتروکسان و نالوکسان به کار می رود. در برخی از جمعیت های این گونه کپسول ها و ریشه ها منحصرا″ دارای میزان بالایی تبائین بوده و بنابراین عصاره گیری و خالص سازی از مواد خام این گیاه به نسبت آسان است. مسیر سنتز تبائین در این گیاه مشابه P. somniferum است. میزان تبائین در ریشه به 7/0 تا 3/1 درصد وزن خشک می رسد که مربوط به کوه البرز در شمال ایران است. میزان تبائین در وزن خشک جمعیت AryaII حداکثر به 6/3 درصد می رسد (Lalezari و همکاران 1974). تبائین به عنوان ماده خام و اولیه برای تولید داروهای نیمه سنتزی چون اکسی کدون می باشد. تولید کنندگان مواد خام برای ساخت این داروها شامل استرالیا، هند، فرانسه، ترکیه، اسپانیا، مجارستان و جمهوری چک می باشند که از طرف سازمان ملل مجوز کشت خشخاش را دارا هستند (Facchini 2008).
1-6- مسیر متابولیکی سنتز تبائین، کدئین و مرفین
آلکالوئیدهای بنزیل¬ایزوکوئینولین گروه بزرگ و متنوعی از محصولات طبیعی شامل بیش از 2500 ساختار شیمیایی مشخص می¬باشند که عمدتا” در پنج خانواده گیاهی یافت می¬شوند (Facchini وهمکاران، 2001). این گیاه بیش از 100 آلکالوئید بنزیل¬ایزوکوئینولین مختلف را تولید می¬کند که برخی از آنها نظیر مرفین و کدئین به عنوان ضد درد، پاپاورین به عنوان شل کننده عضلات، نوسکاپین به عنوان داروی ضد تومور و سانگواینارین به عنوان ترکیب ضد میکروبی از نظر پزشکی دارای اهمیت می¬باشند. Jacksonوهمکاران (2008) نشان دادند که نوسکاپین دارای اثرات ضد توموری بوده و در درمان سرطان شش موثر می باشد. سانگواینارین و ماده ضد تومور نوسکاپین که در ریشه و لاتکس ساقه وجود دارند. نوسکاپین و مورفین در کشت¬های سوسپانسیون سلولی مشاهده نمی شوند که دلیل آن این است که تولید آنها نیاز به سلولهای تمایز یافته دارد و کشت¬های سلولی دارای محدودیت در تنظیم تولید این مسیرهای آلکالوئیدی می باشد.
بیوسنتز آلکالوئید بنزیل¬ایزوکوئینولینی با تبدیل اسید¬آمینه ال-تیروزین به دوپامین و 4-هیدروکسی فنیل-استالدئید توسط شبکه¬ای از واکنش¬های دکربوکسیلاسیون، هیدروکسیلاسیون و دآمیناسیون آغاز می-گردد(شکل-1-2). آنزیم تیروزین/دوپا دکربوکسیلاز (TYDC) تبدیل ال-تیروزین و ال-دوپا به تیرامین و دوپامین را کاتالیز می¬کند. در ادامه در اثر ترکیب دوپامین و 4-هیدروکسی¬فنیل¬استالدهید، اس-نورکوکلائورین (پیش¬ماده مرکزی تمامی آلکالوئیدهای بنزیل¬ایزوکوئینولین در گیاهان) تشکیل می¬گردد (Facchini وهمکاران، 2001؛ Samananini وهمکاران، 2001). اس-کوکلائورین از اس-نورکوکلائورین توسط آنزیم 6-اُ-متیل¬ترانسفراز (6OMT) تشکیل می¬شود (Murishik و همکاران، 2000). در ادامه توسط آنزیم ان-متیل¬ترانسفراز (CNMT ) (Choi و همکاران، 2002) به اس-ان-متیل-کوکلائورین تبدیل می¬شود. در ادامه اس-ان-متیل¬کوکلائورین توسط آنزیم هیدروکسیلاز P450 (CYP80B1) (Paouli و همکاران، 1998) به اس-´3-هیدروکسی-ان-متیل¬کوکلائورین تبدیل می¬کند که آن هم توسط آنزیم ´4-اّ-متیل¬ترانسفراز (4´OMT) (Murishik و همکاران، 2000) به اس-رتیکولین تبدیل می¬گردد. اس-رتیکولین ماده حد واسط کلیدی در تشکیل مرفین و سانگواینارین می¬باشد.

مطلب مرتبط :   t-استیودنت، استانداردشده، نیکویی، رگرسیون، امنیت، شده)

شکل-1-2- بیوسنتز آلکالوئیدهای بنزیل¬ایزوکوئینولینی با تبدیل اسید¬آمینه ال-تیروزین به دوپامین و 4-هیدروکسی فنیل-استالدئید توسط شبکه¬ای از واکنش¬های دکربوکسیلاسیون، هیدروکسیلاسیون و دآمیناسیون

تبدیل اس-رتیکولین به آر-رتیکولین و تبدیل ان به سالوتاردین، اولین مراحل در بیوسنتز مرفین می-باشد(Jerardi وهمکاران، 1993). سالوتاردین به 7 اس-سالوتاردینول احیاء شده و آن هم توسط آنزیم 7اس-سالوتاردینول -7-استیل¬ترانسفراز(SalAT) به سالوتاردینول-7-اّ-استات تبدیل می¬گردد (Grouth و همکاران، 2001). بازآرایی سالوتاردینول-7-اّ- استات منجر به تولید تبائین می¬گردد که در اثر اکسیداسیون تبائین، و از طریق نئوپینون، کدئینون سنتز می¬گردد. آنزیم کدئینون ردوکتاز (CodR) این پیش¬ماده را احیاء و تبدیل به کدئین می¬نماید (Antherlinez و همکاران، 1999). سرانجام مرفین در اثر دمتیلاسیون کدئین تولید می¬شود. به طور متناوب و در زنجیره دیگر، تبائین دمتیله شده و اریپاوین حاصل می¬گردد. در اثر اکسیداسیون اریپاوین، مرفینون تشکیل شده و در اثر احیاء آن توسط کدئینون ردوکتاز مرفین به عنوان محصول نهایی تولید می¬گردد (شکل-1-3).

شکل-1-3- مسیر ساخت مورفین؛ الف) از سالوتاریدینول، ب) از تبائین

1-7- استفاده از روش های مهندسی ژنتیک در بهبود عملکرد تولید آلکالوئیدها
چندین راهبرد جهت بهبود عملکرد تولید آلکالوئیدها تاکنون پیگیری و طراحی شده است. که عبارتند از:
1- غربالگری و انتخاب لاین¬های سلولی با عملکرد بالا و بهینه¬سازی رشد و محیط تولید نظیر تولید شیکونین و بربرین و سانگواینارین.
2- کشت سلول¬های تمایز یافته (ساقه، ریشه و ریشه¬مویی) به همراه القاء توسط محرک¬ها
3- استفاده از مهندسی ژنتیک ( مهندسی متابولیت¬های ثانویه) در جهت بهبود محتوی آلکالوئیدها

1-7-1- ژن¬های مؤثر در بیوسنتز مرفین
چندین ژن کدکننده آنزیمهای بیوسنتزی BIA تاکنون عمدتا” با استفاده از روشهای سنتی بیوشیمیایی، شناسایی و ایزوله شده¬اند. به طور معمولی، آنزیم بیوسنتزی از سلول¬های کشت سوسپانسیونی خالص-سازی شده و پروتئین خالص شده با آنزیم¬هایی اندوپروتئاز نظیر تریپسین هضم می¬گردد. توالی اسیدهای آمینه قطعات پپتیدی جهت طراحی آغازگرهای الیگونوکلئوتیدی مورد استفاده قرار می¬گیرد و قطعات ژنی مورد نظر با استفاده از واکنش زنجیره¬ای پلیمراز (PCR) تکثیر می¬گردد. قطعات DNA تکثیر شده می¬تواند به عنوان کاوشگر جهت جداسازی کلون مولکولی با طول کامل از کتابخانه cDNA مناسب مورد استفاده قرار گیرد. این روش برای جداسازی بسیاری از ژن¬ها در انواع گیاهان مورد استفاده قرارگرفته است (Samanani و همکاران، 2004؛ Ditrikh وهمکاران، 1991؛ Choi و همکاران، 2002).
ژن¬های بیوسنتزی BIA نیز بر اساس موتیف¬های فعال حفظ¬شده جداسازی شده¬اند. معمولا”، ژن¬های بیوسنتزی BIA در میان گونه¬ها حفظ¬شده¬اند (Liscamb و همکاران، 2005)، بنابراین یک کلون مولکولی از گونه¬های وابسته اغلب می¬تواند به عنوان کاوشگر هترولوگوس جهت جداسازی ژن¬های مرتبط از خشخاش مورد استفاده قرار گیرد. به عنوان مثال، ژن ساختاری bbe جهت جداسازی کلون مولکولی BBE از خشخاش استفاده گردید (Facchini و همکاران، 1996). به طور مشابه، کلون¬های مولکولی از C .japonica به عنوان کاوشگر جهت جداسازی cDNA های ژن¬های 6OMT، CNMT و 4´OMT مورد استفاده قرارگرفت (Park و Facchini، 2003). با این¬حال این روش همیشه با موفقیت همراه نیست، کلون مولکولی کدکننده NCS از علف Meadow rue زمانیکه به عنوان کاوشگر جهت غربال کتابخانه cDNA تهیه شده از کشت¬های سلولی خالص خشخاش مورد استفاده شد با شکست در هیبریداسیون با همتای خود همراه بود (مکاتبه شخصی با Facchini ).
مسیر سنتز آنزیمی مرفین در Papaver somniferum تقریبا” به صورت کامل توسط Kutchan و همکاران در سال 1998 تشریح گردید(شکل1-4). مرفین طی نزدیک به 17 مرحله آنزیمی از دو ملکول اسیدآمینه ال-تیروزین (L-tyrosine) بدست می¬آید. در این میان استیل ترانسفراز وابسته به کوآنزیم ¬آ نقش مهمی دارد مراحل بعدی شامل فعالیت 3 آنزیم اکسیدوردوکتاز وابسته به NADP، (Lenz وهمکاران، 1995) سیتوکروم P-450 (Jeradi و همکاران، 1993) و استیل ترانسفراز وابسته به استیل کوآنزیم A است (Lenz وهمکاران، 1995).
آنزیم مرکزی در بیوسنتز مرفین آنزیم سالوتاردینول-7-اُ-استیل ترانسفراز (Slautardinol 7-O-Acetyltransferase) (SalAT) می¬باشد. بخش 7- هیدروکسی سالوتاردینول توسط انتقال یک گروه استیل از استیل¬کوآ به کمک آنزیم سالوتاردینول 7-اُ- استیل¬ترانسفراز فعال می¬شود. تبدیل سالوتاردینول-7-اُ-استات به تبائین به صورت خودبه¬خودی و با حذف استات انجام می¬گیرد که یک واکنش وابسته به pH می¬باشد (Lenz و همکاران، 1995). Toreston و همکاران در سال 2001 موفق به جداسازی کلون cDNA آنزیم SalAT از طریق کشت سوسپانسیون سلولی شدند. کلون cDNA از طریق روش RT-PCR با استفاده از mRNA نمونه P. somniferum تهیه گردید.

مطلب مرتبط :   حجاب، زنان، امنیت، جنسی، متلک، محجبه

شکل1-4- مسیر سنتز آنزیمی مرفین که توسط Kutchan و همکاران در سال 1998 تشریح گردید: مرفین طی نزدیک به 17 مرحله آنزیمی از دو ملکول اسیدآمینه ال-تیروزین (L-tyrosine) بدست می¬آید.

تجمع رونوشت های ژنی آنزیم های درگیر در بیوسنتز آلکالوئیدهای خشخاش Papaver somniferum در شکل 1-5 آمده است. همچنین این آنزیم ها می توانند از طریق منافذ پلاسمودسمی از محل تولید خود (سلول¬های همراه آوند آبکش) به عناصر آوند آبکش منتقل شوند (شکل 1-5)(Facchini و St-Pierre؛ 2005).

شکل 1-5- الف) آنزیم¬ها می توانند از طری