عصاره حاصل با استفاده از دستگاه سانتریفوژ به مدت 5 دقیقه در 10000 دور در دقیقه سانتریفوژ شد. به یک میلیلیتر از محلول رویی حاصل از سانتریفوژ، 5 میلیلیتر محلول تریکلرواستیک اسید 20 درصد که حاوی 5/0 درصد اسید تیوباربیتوریک بود، اضافه شد. مخلوط حاصل به مدت 30 دقیقه در دمای Cº95 حمام آب گرم حرارت داده شد. سپس بلافاصله در حمام یخ سرد گردید و مجددأ به مدت 10 دقیقه در 10000دور در دقیقه سانتریفوژ شد. میزان جذب نمونهها در طول موج 532 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازهگیری شدند. ماده مورد نظر برای جذب در این طول موج کمپلکس قرمز رنگ MDA-TBA است. جذب سایر رنگیزههای غیراختصاصی در 600 نانومتر تعیین و از این مقدار کسر شد. برای محاسبه غلظت مالوندیآلدئید از ضریب خاموشی معادل mM-1cm-1 155 استفاده شد و نتایج حاصل از اندازهگیری بر حسب نانومول بر گرم وزن‌تر محاسبه شد [Heath and Packer, 1969].
2-7-4-2-سنجش سایر آلدئیدها (پروپانال، بوتانال، هگزانال، هپتانال و پروپانال دی متیل استال)
2/0 گرم از بافت تازه برگی از برگهای شاخه اصلی (برگهای توسعه یافته از گرههای 4 و 5) در پایان آزمایش در هاون چینی حاوی 5 میلیلیتر تریکلرواستیک اسید 1/0 درصد سائیده شد. عصاره حاصل با استفاده از دستگاه سانتریفوژ به مدت 5 دقیقه در 10000 دور در دقیقه سانتریفوژ شد. به یک میلیلیتر از محلول رویی حاصل از سانتریفوژ، 5 میلیلیتر محلول تریکلرواستیک اسید 20 درصد که حاوی 5/0 درصد اسید تیوباربیتوریک بود، اضافه شد. مخلوط حاصل به مدت 30 دقیقه در دمای Cº95 حمام آب گرم حرارت داده شد. سپس بلافاصله در حمام یخ سرد گردید و مجددأ به مدت 10 دقیقه در 10000دور در دقیقه سانتریفوژ شد. میزان جذب نمونهها در طول موج 455 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازهگیری شدند. جذب سایر رنگیزههای غیراختصاصی در 600 نانومتر خوانده و از این مقدار کسر گردید. برای محاسبه غلظت سایر آلدئیدها از ضریب خاموشی معادل mM-1cm-1105×457/0 استفاده شد. این ضریب خاموشی میانگین ضریب خاموشی برای آلدئیدهای مورد نظر است [Meirs et al, 1992].
2-7-5-پراکسید هیدروژن
5/0 گرم از بافت تازه برگ از برگهای شاخه اصلی (برگهای توسعه یافته از گرههای 4 و 5) در پایان آزمایش در هاون چینی حاوی تریکلرواستیک اسید 1/0 درصد سرد سائیده شد. عصاره حاصل به مدت 15 دقیقه با استفاده از دستگاه سانتریفوژ یخچالدار به مدت 5 دقیقه در 10000 دور در دقیقه سانتریفوژ شد. سپس به 500 میکرو لیتر از محلول رویی، 500 میکرو لیتر بافر فسفات پتاسیم 100 میلیمولار (7=pH) و 2 میلیلیتر یدید پتاسیم 1 مولار اضافه شد. مخلوط واکنش به مدت 1 ساعت در تاریکی در دمای اتاق قرار داده شد. میزان جذب نمونهها در طول موج 390 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازهگیری شدند. غلظت پراکسید هیدروژن با استفاده از ضریب خاموشی معادل1 M-1cm-28/0 محاسبه و بر حسب میکروگرم در گرم وزن تر گیاهی محاسبه شد [Veilkova et al., 2000].
2-7-6-پروتئین محلول کل و سنجش فعالیت آنزیمها
2-7-6-1-تهیه بافر استخراج
تهیه بافر فسفات 50 میلی مولار با pH برابر 7 به‌صورت زیر می‌باشد:
1- 68/0گرم نمک پتاسیم دی هیدروژن فسفات (KH2PO4) به همراه 2 گرم PVPP و Na-EDTA در 50 میلی‌لیتر آب مقطر حل شدند و حجم آن به 100 میلی لیتر رسانده شد.
2- 87/0گرم نمک پتاسیم مونوهیدروژن فسفات (K2HPO4) به همراه 2 گرم PVPP و Na-EDTA در 50 میلی‌لیتر آب مقطر حل شدند و حجم آن به100 میلی‌لیتر رسانده شد.
3- محلولهای 1 و2 به عنوان محلولهای ذخیره بودند که در هر بار آزمایش 39 میلی‌لیتر از محلول 1 با 61 میلی‌لیتر از محلول 2 مخلوط شده و pH آن با استفاده از pH‌ متر بین2/7-8/6 تنظیم میشد.
2-7-6-2-مرحله استخراج
بهمنظور استخراج و اندازه‌گیری پروتئین محلول کل و آنزیم‌ها، برگ‌های فریز شده در هاون چینی ریخته و نیتروژن مایع به آن اضافه شد. سپس برگ‌ها بهخوبی کوبیده شده تا کاملاً خرد شوند. 5/0 گرم از پودر برگ آسیاب‌شده به میکروتیوب‌های 2 میلی‌لیتری منتقل شدند و یک میلیلیتر از بافر استخراج به آن اضافه و به مدت 30 ثانیه ورتکس شدند. سپس به مدت 15 دقیقه با 14000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد، سانتریفوژ شدند. پس از اتمام سانتریفوژ عصارههای رویی با استفاده از سمپلر برداشته شدند و به میکروتیوب‌های 5/1 میلی‌لیتری منتقل شدند و دوباره به مدت 10 دقیقه با 14000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد، سانتریفوژ شدند. پس از اتمام سانتریفوژ، عصارههای رویی با استفاده از سمپلر برداشته و به میکروتیوب‌هایی با همان حجم منتقل شدند. میکروتیوب‌های حاوی عصارهها در زمان سایش برگ‌ها و سانتریفوژ نمونه‌های دیگر در داخل ظرف یخ نگهداری شدند و در صورت عدم استفاده به فریزر80- درجه سانتی‌گراد انتقال داده شدند [Beauchamp and Fridovich, 1971]. از این عصارهها برای سنجش محتوای پروتئین محلول کل و آنزیمهای پراکسیداز، آسکورباتپراکسیداز وکاتالاز استفاده شد.
2-7-6-3-پروتئین محلول کل
2-7-6-3-1-تهیه بافرهای سنجش
1) معرف بردفورد: 100 میلیگرم کوماس بلوجی 250 را با 50 میلی لیتر اتانول خالص مخلوط و به حجم 800 میلیلیتر رسانده شد. سپس محلول به دست آمده از صافی عبور داده شد و حجم محلول صاف شده با 100 میلیلیتر اسید فسفریک خالص و آب مقطر به 1000 میلیلیتر رسانده شد.
2) محلول استاندارد: 5 میلیگرم آلبومین گاوی در 1 میلیلیتر بافر استخراج حل شد. سپس محلول حاصل به هم زده شد و در آب یخ قرار داده شد. سپس به ترتیب طبق جدول زیر، مقادیر فوق از محلول استاندارد و معرف بردفورد برداشته شد و با یکدیگر مخلوط شدند.
جدول 2-6-مقادیر برداشته شده از محلول استاندارد و بردفورد به منظور تهیه جدول استاندارد بر حسب میکروگرم در میلیلیتر
600
450
300
150
60
30
12
محلول BSA (µl/3Ml)
1000
750
500
250
100
50
20
برابر با BSA (µg/Ml)
2400
2550
2700
2850
2940
2970
2988
میزان محلول بردفورد (میکرولیتر)
2-7-6-3-2-تعیین محتوای پروتئین محلول کل
50 میکرولیتر از محلول عصاره رویی حاصل برداشته شد و 2950 میکرولیتر از معرف بردفورد به آن اضافه شد. سپس میزان جذب نمونههای عصاره و استاندارد پس از 15 دقیقه در طول موج 595 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازهگیری شدند [Bradford, 1976].

مطلب مرتبط :  

شکل 2-4- منحنی و معادله استاندارد پروتئین
2-7-6-4- آنزیم پراکسیداز (POD)
2-7-6-4-1-تهیه بافرهای سنجش
1) بافر آب اکسیژنه (H2O2) 225 میلی مولار: برای این منظور 450 میکرو لیتر H2O2 با بافر فسفات به حجم 20 میلی‌لیتر رسانده شد. محلول‌ها به عنوان سوبسترا باید در هر بار اندازه‌گیری تازه باشند.
2) بافر گایاکول 45 میلی مولار: برای این منظور 112 میکرولیتر گایاکول با بافر فسفات به حجم 20 میلیلیتر رسانده شد.
2-7-6-4-2-تعیین فعالیت آنزیم
بافر H2O2 به مقدار 495 میکرولیتر و بافر گایاکول به همان مقدار در دمای پایین (ظرف حاوی یخ) با هم مخلوط شدند و به آنها 10 میکرولیتر عصاره آنزیمی اضافه و سپس میزان جذب در طول موج 470 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازهگیری شد. در محلول بلانک به جای عصاره آنزیمی، 10 میکرولیتر از بافر فسفات 50 میلی مولار (7 pH=) استفاده شد. فعالیت آنزیمی با استفاده از فرمول قانون بیر لامبرت و ضریب خاموشی گایاکول پراکسیداز (µM-1c-1m6/26)، محاسبه و فعالیت آنزیم در نهایت بر حسب µmol/g FW.min محاسبه شد [Cesar et al., 2010].
2-7-6-5-آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX)
2-7-6-5-1-تهیه بافرهای سنجش
1) محلول بافر فسفات 25 میلیمولار و با pH برابر 7.
2) بافر اندازه‌گیری: این بافر حاوی بافر پتاسیم فسفات، EDTA 1/0 میلیمولار، آسکوربیک اسید 5/0 میلی‌مولار و H2O2 10 میلی‌مولار است.
2-7-6-5-2-تعیین فعالیت آنزیم
سنجش فعالیت آنزیم از طریق اندازه‌گیری اکسید شدن آسکوربات توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، در طول موج 290 نانومتر برای مدت زمان 1 دقیقه انجام شد. برای این منظور ابتدا نمونه بلانک (با حجم نیم میلی‌لیتر) حاوی 490 میکرولیتر از بافر شماره 2 و 10 میکرولیتر بافرفسفات، نمونههای عصاره (با حجم نیم میلی‌لیتر) حاوی 490 میکرولیتر از بافر شماره 2 و 10 میکرولیتر از عصاره آنزیمی تهیه شد و پس از بهمزدن (یعنی با گذاشتن پارافیلم بر روی کووت) سرعت واکنش آنزیمی به‌صورت تغییرات جذب بر زمان (OD/min) در طول موج nm290 برای 1 دقیقه ثبت شد. فعالیت آنزیمی با ضریب خاموشی mM-1cm-18/2 محاسبه شد [Nakano and Asada, 1981].
2-7-6-6-آنزیم کاتالاز (CAT)
2-7-6-6-1-تهیه بافرهای سنجش
محلول بافر فسفات 25 میلیمولار و با pH برابر 7
بافر اندازه‌گیری: این بافر حاوی بافر پتاسیم فسفات، EDTA 1/0 میلیمولار و H2O2 10 میلی مولار است.
2-7-6-6-2-تعیین فعالیت آنزیم CAT
سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز از طریق اندازه‌گیری تجزیه آب اکسیژنه توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، در طول موج 240 نانومتر برای مدت زمان 1 دقیقه انجام شد. برای این منظور ابتدا نمونه بلانک (با حجم نیم میلی‌لیتر) حاوی 495 میکرولیتر از بافر شماره 2 و 5 میکرولیتر بافر فسفات، نمونههای عصاره (با حجم نیم میلی‌لیتر)، حاوی 495 میکرولیتر از بافر شماره 2 و 5 میکرولیتر از عصاره آنزیمی تهیه شد و پس از بهمزدن (یعنی با گذاشتن پارافیلم بر روی کووت) سرعت واکنش آنزیمی به‌صورت تغییرات جذب بر زمان (OD/min)، در طول موج nm240 برای 1 دقیقه ثبت شد. فعالیت آنزیمی با ضریب خاموشی µM-1c-1m40 محاسبه شد [Chance and Maehly, 1955].
2-8- عناصر معدنی ریشه و برگ
2-8- 1- تهیه خاکستر
به منظور انداره گیری عناصر غذایی، پس از اتمام دوره آزمایش، برگها و ریشهها جدا شدند و پس از شستشوی دقیق، به مدت 48 ساعت در آون با دمای 75 درجه سانتی گراد قرار داده شدند. پس از خشک شدن برگها، نمونهها با آسیاب برقی به صورت پودر در آورده شدند. پس از تهیه خاکستر از مواد گیاهی در دمای 550 درجه سانتی گراد، عصاره گیری با استفاده از 10 میلی لیتر کلریدریک اسید ٢ نرمال و آب مقطر و رساندن به حجم ۵٠ میلی لیتر انجام شد ]امامی، 1375[.
2-8-2-نیتروژن
25/0 گرم از نمونه گیاهی ریشه و برگ که به صورت کاملا یکنواخت پودر شده بود، در تیوپ شیشه ای مخصوص ریخته شد و 10 میلی لیتر اسید سولفوسالیسلیک (50 گرم اسید سالیسیلیک + یک لیتر اسید سولفوریک) + دو گرم کاتالیزور (100 گرم سولفات پتاسیم + 10 گرم سولفات مس + یک گرم سلنیوم) + 20 میلی لیتر آب مقطر به آن اضافه شد. محلولها به مدت سه ساعت در دمای 420 درجه حرارت داده شدند تا در کف شیشهها، عصاره سبز رنگی باقی بماند که نشانه آماده شدن عصاره به منظور تیتراسیون بود.
سپس به هر یک از تیوپهای شیشهای، حدود 20 میلی لیتر آب مقطر اضافه شد و تقطیر و تیتراسیون با دستگاه تمام اتوماتیک کجلدال انجام گرفت و مقدار نیتروژن موجود در برگ و ریشه طبق فرمول زیر (2-12)، بر حسب گرم درصد بیان شد ]امامی، 1375[.
B=1.401*m*v1/w*c*v2 (2-12)
که در آن:
M: مولاریته اسید
C: ظرفیت اسید
W: وزن نمونه گیاه جهت هضم بر حسب گرم
V1: حجم عصاره نهایی از مرحله هضم بر حسب میلیلیتر
V2: حجم عصاره مورد استفاده جهت عمل تقطیر
2-8-3-پتاسیم
2-8-3-1- آماده کردن محلول‌های سنجش
1) محلول کلروسزیم با غلظت 87/0 گرم در لیتر: 1/1 گرم کلروسزیم صددرصد خاص در بالن ژوژه یک لیتری ریخته شد و با افزودن آب مقطر به حجم یک لیتر رسانده شد.
2) محلول استاندارد غلیظ پتاسیم به غلظت 5000 میلی گرم در لیتر (1): مقدار 534/9 گرم کلرور پتاسیم خشک شده در دمای 105 درجه سانتیگراد در آون را در بالن ژوژه‌ی یک لیتری ریخته شد و با استفاده از آب مقطر به حجم یک لیتر رسانده شد.
3) محلول استاندارد پتاسیم 500 میلیگرم در لیتر (2): 100 میلیلیتر از محلول استاندارد بالا در بالن ژوژه یک لیتری ریخته شد و با افزودن آب مقطر به حجم یک لیتر رسانده شد.
4) سری محلول‌های استاندارد (3): از محلول استاندارد 2، بترتیب مقادیر 0، 1، 2، 3، 4 و 5 میلی‌لیتر با پیپت برداشته شد و در بالن ژوژه‌ی 100 میلی‌لیتری با آب مقطر به حجم 100 میلی‌لیتر رسانده شد.
2-8-3-2- تعیین محتوای پتاسیم
مقدار 5 میلی‌لیتر از عصارههای‌ تهیه شده در بالن ژوژه‌های 50 میلی‌لیتری با محلول کلروسزیم 87/0 گرم در لیتر به حجم رسانده شدند و سپس مقدار پتاسیم موجود در نمونهها با استفاده از دستگاه فلیم فتومتر (JENWAY مدل PFP7)، پس از کالیبره کردن دستگاه با محلولهای استاندارد و شاهد اندازه‌گیری و طبق فرمول زیر (2-13)، بر حسب گرم درصد محاسبه شد ]امامی، 1375[.
K٪ = (a DDV)/(10000/m) m (100/D.m) (2-13)
که در آن:
a: عدد بدست آمده از منحنی
D: عدد رقت
V: حجم محلول حاصل از انحلال خاکستر
m: وزن

مطلب مرتبط :   علومانسانی، قرآن، فلسفه، هستیشناسی، آیات، سرشت