دانلود پایان نامه

آزاد دیسفانی و همکاران (1392) تغییرات فعالیت آنزیم بتا-1و3 گلوکاناز و میزان فنل کل عصاره ریشهچه پنبه را با استفاده از روشهای کالریمتری و دستگاه اسپکتروفتومتر بررسی نموده و نشان دادند که حداکثر میزان این ترکیبات در عصاره ریشهچه گیاهان تیمار شده با جدایههای تریکودرما به همراه قارچ رایزوکتونیا وجود دارد. ارزیابی فعالیت آنزیم بتا-1و3 گلوکاناز نیز نشان داد که قارچ تریکودرما و رایزوکتونیا هر کدام به تنهایی باعث افزایش فعالیت این آنزیم و در نتیجه القاء مقاومت در گیاهچه پنبه میشوند. اما تیمار تریکودرما بههمراه قارچ عامل بیماری نسبت به تیمار جدایه تریکودرما به تنهایی، تیمار عامل بیماری به تنهایی و نیز شاهد سالم، موجب افزایش بیشتر فعالیت آنزیم بتا 1و3 گلوکانازمیشود.
مطابق با نظرات Heil and Ploss (2006) آنزیم بتا-1 و 3 گلوکاناز پس از زخمی شدن گیاه و یا آلودگی بیولوژیک، تشکیل و فعالیتهای آن القاء میشود. طی تحقیقاتی دیگری نشان داده شد که فعالیت پراکسیدازها، بتا-1و3 گلوکانازها و کیتیازها در اثر استفاده از یک نوع رایزوکتونیای دو هستهای در گیاهچههای لوبیا افزایش یافته و این افزایش ارتباط نزدیکی با افزایش مقاومت به پوسیدگی ریشه ناشی از R. solani داشت (Xue et al., 1988).
فصل سوم
مواد و روش ها
3-1- مواد مورد نیاز
موادآزمایشی شامل قارچ عامل بیماری Verticilium dahliae ، گلخانه، گلدان، بذر پنبه، کیسههای پلاستیکی نمونه برداری، قیچی، لولههای آزمایش، ظروف پتری، محیط های کشت، مواد شیمیائی، اتوکلاو، هود استریل، میکروسکوپ و انکوباتور بوده که مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی مازندران تامین گردید.
3-2- روش تحقیق
3-2-1- تهیه محیط های کشت مورد استفاده جهت جداسازی و رشد جدایه ها
3-2-1-1- محیط کشت آب آگار (WA)
برای تهیه این محیط مقدار 20 گرم پودر آگار را در 1 لیتر آب مقطر حل کرده و محیط حاصل به مدت 15 دقیقه در حرارت 121 درجه سانتی گراد در اتوکلاو سترون گردید. از این محیط کشت برای تک ریسه کردن و خالص سازی جدایه های قارچ و همچنین نگهداری جدایه های خالص شده در لوله های آزمایشگاهی در محیط 4 درجه سانتی گراد استفاده شد.
3-2-1-2- محیط کشت سیب زمینی، دگستروز آگار(PDA)
از این محیط کشت جهت جداسازی، تعیین رنگ کلونی، میزان رشد پرگنه و بررسی ویژگیهای خصوصیات ظاهری جدایه های قارچ استفاده شد. برای این منظور از محیط کشت PDA به میزان 39 گرم پودر آماده آنرا به یک لیتر آب مقطراضافه و محیط حاصل را حرارت داده تا کاملا حل گردد. سپس محیط فوق در دمای 121 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه در اتوکلاو سترون گردید.
3-3- نمونه برداری بوته های آلوده به قارچ Verticillum daheliae
به منظور جمع آوری بوتههای آلوده پنبه در تیر ماه سال 1392 مزارع مختلف پنبه واقع در شهرستان گنبد کاووس مورد بازدید قرار گرفت. بوتههای پنبه آلوده و مشکوک از 5 مزرعه جمع آوری و به آزمایشگاه انتقال داده شد. نمونه ها تا زمان بررسی در دمای 4درجه سانتی گراد نگهداری شدند.
3-4- جداسازی قارچ عامل بیماری
جهت جداسازی قارچ نمونههای انتقال داده شده به آزمایشگاه، ابتدا با آب شستشو شدند. سپس بخشهائی از طوقه و ریشه آلوده انتخاب و به قطعاتی به ابعاد 1 × 1 سانتیمتر جدا و با هیپوکلریت سدیم 10 درصد تجارتی به مدت 30-60 ثانیه ضدعفونی سطحی شدند. قطعات ضدعفونی شده پس از 3 بار شستشو با آب مقطر استریل، هر بار به مدت 3 تا 4 دقیقه و خشک کردن با کاغذ صافی استریل، در پتریهای حاوی محیط کشت PDA کشت و در دمای 25 درجه سانتی گراد در شرایط تاریکی نگهداری شدند (Kim et al., 2001).
خالص سازی قارچ بهروش تک اسپور روی محیط کشت آب آگار انجام گرفت (Jones and Clifford, 1983).
3-5- آزمون بیماریزائی جدایهها
آزمون بیماریزائی جدایهها روی پنبه رقم ساحل (حساس به بیماری) تعیین و جدایههای با قدرت بیماریزائی بیشتر بهعنوان جدایههای برتر برای آزمونهای بعدی انتخاب شدند. در این رابطه تعداد 100عدد بذر پنبه پس از ضد عفونی سطحی با هیپوکلریت سدیم، جوانه دار شده و جهت مایه زنی به مدت 2 ساعت به در سوسپانسیون اسپور قارچ V. daheliae با غلظت مناسب (106×1 اسپوردر هر میلیلیتر) قرار گرفتند. بعد از حذف سوسپانسیون اضافی، بذور تلقیح شده در پتری دیش حاوی 3 برگ کاغذ صافی استریل مرطوب قرار گرفتند. در این آزمایش در تیمار شاهد به جای سوسپانسیون اسپور، از آب مقطر استریل استفاده گردید. پتری دیش حاوی بذور تلقیح شده در کیسههای پلاستیکی نگهداری شدند. بعد از ظهور علائم بیماری روی گیاهچهها، درصد آلودگی با استفاده از فرمول ذیل تعیین شد (Schteinberg, 1997) :
DI=[(a-b)/a×100]
DI= درصد آلودگی