آن¬ها.<br />- به وفور در ژنوم یوکاریوت ها یافت می¬شوند.
معایب نشانگر:
– شناسایی ریزماهواره¬ها، تعیین ردیف بازی آن¬ها، طراحی و ساخت آغازگرها و تهیه نقشه ژنتیک ریزماهواره¬ها که مقدمه کاربرد این نشانگر است، بسیار پیچیده و مستلزم صرف وقت و هزینه زیاد است.
– کمبود تعداد ریزماهواره¬های شناخته شده در برخی از موجودات، استفاده از آن¬ها را در مکان¬یابی ژن¬ها محدود کرده است.
– در صورت توزیع نامناسب ریزماهواره¬ها در طول ژنوم کاربرد موثر آن¬ها در مکان¬یابی ژن¬ها محدود می¬گردد [20].
مزیت نشانگرهای ریزماهواره نسبت به نشانگرهای RAPD و PCR-RFLP ، اختصاصی بودن بالای آن و پلی¬مورفیسم بالا و قابلیت تکثیر (تکرارپذیری) خوب است [86]. ریزماهواره¬های پلی¬مورفیسم به عنوان نشانگر ژنتیکی برای ارزیابی تنوع ژنتیکی در جمعیت¬های پاتوژن¬های قارچی گیاهی استفاده شده است [87، 86].
در طی مطالعاتی که توسط مرادزاده و همکاران در سال 1388 انجام گرفت تنوع ژنتیکی Fusarium oxysporum عامل پژمردگی فوزاریومی سیب¬زمینی با استفاده از آزمون¬های بیماری¬زایی و نشانگر RAPD بررسی شد. در این بررسی، طی تجزیه خوشه ای داده¬ها با استفاده از ضریب تشابه دایس ، در سطح شباهت 71 درصد، جدایه¬ها در هشت گروه ژنوتیپی قرار گرفتند. بین تنوع ژنتیکی و منشاء جغرافیایی جدایه¬ها ارتباطی مشاهده نگردید [17].
در سال 2000 میلادی بارو و همکاران تحقیقی تحت عنوان، توانایی میکروستلایت¬ها در تشخیص 4 نژاد Fusarium oxysporum f. sp. ciceriرایج در هند انجام دادند که در این آزمایش سیزده نشانگر الیگونوکلئوتیدی مکمل با جایگاه¬های میکروستلایت¬ها به همراه 11 آنزیم محدود¬کننده استفاده شدند الگوهای هیبریدی که به آنزیم محدود¬کننده و توالی الیگونوکلئوتیدی وابسته است، حضور موتیف¬های تکراری مختلف را در ژنوم F. oxysporum f. sp. ciceriنشان داد. بسته به سطوح پلی-مورفیسم مشخص شده، (AGT)5، (ATC)5 و (GATA)4 به عنوان بهترین پروب ¬های انگشت¬نگاری برای نژادهای F. oxysporum f. sp. ciceriمشخص شدند [32]. پراکنش تکرارهای میکروستلایت¬ها در ژنوم نشان داد نژادهای 1 و 4 ارتباط نزدیکی دارند ومیزان شاخص تشابه آن¬ها 6/76 % است، که درمقایسه با نژاد 2 میزان شاخص تشابه برابر3/67 % بود، در عوض نژاد 3 از لحاظ میزان تشابه خیلی مجزا و متفاوت بود به¬طوری¬که میزان تشابه 7/26 % بود. مطالعات نشان دهنده توانایی پروب¬های الیگونوکلئوتیدی برای انگشت¬نگاری و مطالعه تنوع در نژادهای F. oxysporum f. sp. ciceri می¬باشد و نمایان¬گر یک قدم به سمت شناسایی مارکرهای تشخیصی نژادهای بالقوه است [32]. در سال2001، ماریا دلمار و همکارانش در اسپانیا به منظور شناسایی نژادهای بیماری¬زای 0، B/C1، 5 و 6 در F. oxysporum f. sp. ciceri بررسی¬هایی را انجام دادند که نتایج آنالیز خوشه¬ای داده¬های حاصل از RAPD نشان داد که جدایه¬های عامل زردی در دو گروه مجزا قرار می-گیرند که مربوط به نژادهای 0 وB/C1 بودند. جدایه¬های مربوط به پژمردگی یک گروه دیگری را که شامل نژادهای A1، 2، 3، 4، 5 و6 بودند، تشکیل دادند. به طور کلی نتایج این تحقیق وسیله¬ای برای مطالعه گسترش نژادهایF. oxysporum f. sp. ciceri و همچنین کمک به تولید و گسترش هرچه بیشتر میزبان¬های مقاوم موجود را فراهم آورد [58].
در سال 2003 زاکر تولایی با استفاده از 15 آغازگر RAPD، تنوع ژنتیکی موجود بین جدایه¬های مختلف F. oxysporum آوندی نخود را در استان خراسان، مورد بررسی قرار داد. بر اساس این مطالعه، بین منشاء جغرافیایی جدایه¬های و گروه¬های ژنوتیپی، ارتباط محسوسی موجود نبود. به علاوه، این نشانگر به خوبی توانست جدایه¬های بیماری¬زا و غیر بیماری¬زا را در نخود تفکیک نماید [98]. اولین گزارش از تجزیه و تحلیل تنوع بین جدایه¬های F. oxysporum f.sp. ciceri با استفاده از نشانگر RAPD در شمال هندوستان ارائه شده است. در این تحقیق، از 40 آغازگر به منظور بررسی تنوع ژنتیکی موجود بین جدایه¬ها استفاده شد. از بین این آغازگرها، فقط چهار آغازگر چندشکلی خوبی را نشان دادند. بر اساس نتایج حاصل از این تکنیک، جدایه¬ها بر اساس منشاء جغرافیایی از هم تفکیک شدند [90].
در مطالعه ای دیگر فوری در سال 2008 بیولوژی تکاملی F. oxysporum f.sp. cubense را با استفاده از نشانگرهای SSR، RFLP و RAPD و همچنین گروه¬های سازگار رویشی (VCGs) مورد بررسی قرار داد. این تحقیق با استفاده از 239 جدایهF. oxysporum f.sp. cubense انجام گرفت که نشان داد تعیین گروه¬های سازگار رویشی در ترکیب با بررسی¬های فیلوژنی ابزار قوی در تشخیص جدایه¬های F. oxyspoum f. sp. ciceri هستند در این بررسی ترکیب فیلوژنی چندژنی، حضور اجداد غیر¬مرتبط را نشان داد که احتمالا گونه های پنهان هستند [46]. در سال 2009 میلادی مامتا شارما و همکارانش تنوع ژنتیکی در جدایه¬های هندی F. oxysporum f. sp. ciceri را بررسی کردند. در این بررسی 48 جدایه مورد بررسی قرار گرفت که 41 نمونه از آن¬ها بیماری¬زا و 7 عدد از آنها غیر¬بیماری¬زا بودند در بین جدایه های بیماری¬زا تنها اختلاف آن¬ها در قدرت بیماری ¬زایی آنها بود در این بررسی بین میزان بیماری¬زایی و منطقه جغرافیایی هیچ¬گونه رابطه مستقیمی به¬دست نیامد نتایج حاصل از تحقیق حاضر جدایه¬های مورد بررسی را بر اساس نشانگر AFLP و آنالیز خوشه¬ای UPGMA در دو گروه بزرگ بیماری¬زا و غیر¬بیماری¬زا قرار داد جدایه¬های بیماری¬زا بر اساس همین آنالیز در شش گروه بزرگ با تشابه ژنتیکی 77/0 قرار گرفتند، تنها تفاوت این جدایه¬ها در شدت و قدرت بیماری¬زایی آن¬ها بود. همچنین یافته¬های این تحقیق بیانگر این امر بود که بین منطقه جغرافیایی و میزان بیماری¬زایی هیچ گونه ارتباطی وجود ندارد. نتایج این تحقیق شاهدی بر قدرت تشخیص و تمایز بالای آنالیز¬های AFLP بود بر این اساس پیشنهاد می¬شود که از این نشانگر برای توصیف مولکولی F.oxysporum f.sp.ciceri استفاده شود [89]. طاهری و همکاران در سال 2010 تحقیقی تحت عنوان بیماری¬زایی و ویژگی¬های ژنتیکی F. oxysporum f.sp. lentis بوسیله نشانگرهای RAPD و IGS در استان خراسان را انجام دادند. نتایج این تحقیق نشان داد که بین مناطق جغرافیایی و بیماری¬زایی جدایه¬ها هیچ ارتباطی وجود ندارد [95].
کریمیان و همکاران در سال 2010 تنوع ژنتیکی F. oxysporum را در لوبیای معمولی و انتشار تیپ¬های آمیزشی آن را بررسی کردند. در این تحقیق با استفاده از نشانگر RAPD و بررسی گروه¬های سازگار رویشی (VCG) 20 جدایه مورد بررسی را در 10 گروه قرار دادند.
در سال 2011 چهری و همکاران تنوع ژنتیکی گونه¬های فوزاریوم را با استفاده از PCR-RFLP-ITS در کرمانشاه در خانواده کدوئیان بررسی کردند براساس تحلیل مناطق ITS DNA ریبوزومی و RFLP، پنج گونه فوزاریوم در دو گروه قرار گرفتند. گروه بندی نژاد¬های فوزاریوم که با استفاده از نشانگر RFLP انجام گرفت با طبقه¬بندی مورفولوژیکی استفاده شده مطابقت داشت. این اولین گزارش از شناسایی این بیماری روی کدوئیان در ایران است [38].
در سال 2011، داتا و همکاران تنوع مولکولی جدایه¬های پژمردگی آوندی ناشی ازF. oxysporum f. sp. Lentis را روی عدس در هند با استفاده از نشانگر¬های SSR، RAPD و PCR-RFLP بررسی کردند، بر اساس این مطالعه که با استفاده از 100 جدایه F. oxysporum f. sp. Lentis انجام گرفت، سه نشانگر مولکولی به کار رفته درجه بالای از تنوع ژنتیکی در جدایه¬ها را از خود نشان دادند که این تنوع از 54 درصد در نشانگر RAPD تا 35 درصد با نشانگر ITS متغییر بود. دندروگرام رسم شده براساس ضریب تشابه، جدایه¬ها را در دو گروه قرار داد. جدایه¬های شمال هند در یک گروه و جدایه¬های منطقه شمال شرق و شرق در گروه دیگر قرار گرفتند [42].
در بررسی¬بعمل آمده توسط داتا و لال در سال 2012 که تحت عنوان کاربرد نشانگرهای مولکولی به منظور تفکیک ژنتیکی نژادهای بیمارگر عامل پژمردگی نخود ولوبیای سودانی، در نواحی وسیعی از هند انجام گرفت از سه نشانگر مولکولی RAPD، ITS-RFLP و SSR به منظور تمایز و تفکیک نژادها استفاده شد. آنالیز خوشه¬ای داده¬های حاصل از نشانگرهای SSR و RAPD، 14 جدایه F. oxysporum f. sp. ciceriرا در چهار گروه بزرگ قرار داد. داده¬های حاصل از ITS-RFLP جدایه¬های مورد بررسی را در سه گروه بزرگ قرار داد. در مجموع آنالیزهای مربوط به این تحقیق نشان داد که گروه¬بندی جدایه¬های بیماری¬زا هیچ ارتباطی به منطقه جغرافیایی ندارد [41]. در سال 2012 ذکایی و همکاران در استان¬های خراسان شمالی و رضوی به منظور بررسی تنوع ژنتیکی جدایه¬های قارچ عامل پژمردگی و زردی نخود از دو نشانگر مولکولی PCR-RFLP و RAPD استفاده نمودند که بعد از بررسی الگوهای باندی 14 آغازگر RAPD، میزان قرابت ژنتیکی 20 جدایه بر اساس فاصله ژنتیکی به صورت دندروگرام رسم گردید، تجزیه و تحلیل دندروگرام RAPD نشان داد که بین منشاء جغرافیایی جدایه¬ها و گروه¬های ژنتیکی، ارتباط معنی¬داری وجود ندارد. در روش RFLP نیز بین منشاء جغرافیایی جدایه¬ها با گروه-بندی خوشه¬ای آن¬ها، رابطه آشکاری وجود نداشت.

مطلب مرتبط :   مالیاتی، کیفری، مجازات، عدالت، حقوق، جرایم

فصل سوم
مواد و روش ها

3-1- نمونه¬برداری
نمونه¬برداری در اواخر اردیبهشت ماه سال زراعی 92-1391 از مناطق مختلف کشت نخود استان ایلام شامل آسمان آباد، سرابله، ایوان، چرداول، دره شهر و بدره انجام گرفت. نمونه¬برداری¬ها به روش تصادفی بود وبه منظور جداسازی قارچ فوزاریوم از گیاهان آلوده از تمامی اندام¬های آلوده به بیماری اعم ساقه، ریشه و طوقه گیاهان مشکوک به آلودگی نمونه-برداری به عمل آمد. (شکل3-1).

شکل3-1- موقعیت جغرافیایی استان ایلام در نقشه ایران و نقاط دقیق نمونه برداری شده در سطح استان
نمونه¬های جمع¬آوری شده از هر منطقه با ذکر موقعیت دقیق جغرافیایی هر منطقه و تاریخ جمع¬آوری درون پاکت¬های مجزایی قرار گرفتند، پس از انتقال پاکت¬ها به آزمایشگاه نمونه¬های آلوده به منظور پاک شدن گل و لای شسته و سپس خشک شدند، بعد از این مرحله نمونه¬ها برای جداسازی قارچ و استفاده¬های بعدی در آزمایشگاه نگه¬داری گردید (شکل3-2). مشخصات جدایه-های فوزاریومی بدست آمده از مناطق مختلف ایلام در جدول (3-1) آورده شده است.

شکل 3-2- ریشه¬ها و ساقه¬های گیاه نخود آلوده به بیماری زردی و پژمردگی جمع¬آوری شده از مناطق مختلف کشت نخود در استان ایلام

3-2-جداسازی قارچ عامل بیماری از بافت¬های گیاهی آلوده
انتخاب روش جداسازی به چند عامل مثل طبیعت و تعداد نمونۀ گیاهی، گونۀ فوزاریوم مورد مطالعه و ضرورت جداسازی سایر قارچ¬های دیگر بستگی دارد، به عبارتی جداسازی گونه¬های فوزاریوم از گیاهان، تحت تأثیر ماهیت بافت آلوده، روش کشت نمونه، محیط کشت و شرایط رشد و نگه¬داری قارچ قرار دارد [13].
برای جداسازی جدایه¬های فوزاریوم از محیط کشت سیب زمینی-دکستروز-آگار اسیدی و همچنین PDA حاوی آنتی¬بیوتیک تتراسایکلین استفاده گردید. ابتدا اندام¬های گیاهی و به خصوص ساقه و ریشه بوته¬های آلوده با آب معمولی شسته و از قسمت¬های مختلف ریشه، طوقه و ساقه قطعات 3-5 میلی¬متری تهیه گردید. قطعات به¬دست آمده در هیپوکلریت 5/0 درصد به مدت 2-5/1 دقیقه سترون و سه مرتبه با آب مقطر سترون شسته شدند. سپس با قرار دادن قطعات بر روی دستمال کاغذی سترون، خشک و در هر تشتک پتری تعداد 6-5 قطعه از آن¬ها را قرار داده و در دمای cᵒ25 نگه¬داری شدند، پرگنه قارچ پس از 3-4 روز ظاهر گردید. پس از ظاهر شدن پرگنه قارچ به منظور جداسازی و خالص¬سازی جدایه¬های مورد نظر از تکنیک-های خالص¬سازی و محیط کشت¬های مختص به آن استفاده کردیم.
3-3- محیط کشت های مورد استفاده
برای جداسازی وخالص¬سازی جدایه¬های مورد مطالعه تعداد متنوعی از محیط کشت¬های عمومی و اختصاصی استفاده گردید که در زیر به شرح آنها خواهیم پرداخت.
3-3-1- محیط کشت های جداسازی
3-3-1-1-محیط کشت PDA
PDA یک محیط غنی از هیدرات کربن است، تهیه محیط کشت عصاره سیب زمینی-دکستروز-آگار به دو صورت امکان¬پذیر است که ما در این پایان¬نامه از هر دو شکل آن استفاده کردیم:
الف)به صورت پودر آماده تجارتی، که برای آماده¬سازی آن جهت استفاده از 39 گرم پودر تجاری در 1لیتر آب مقطر سترون استفاده گردید وسپس برای سترون کردن محیط کشت آن را در اتوکلاو به مدت 20 دقیقه در فشار 5/1 اتمسفر و دمای 121 درجه سانتی-گراد قرار دادیم.
ب)به صورت دستی که از مخلوط 20 گرم دکستروز، 20 گرم آگار و عصارۀ 250 گرم سیب زمینی پخته شده و افزایش آب تا حجم یک لیتر تهیّه گردید، بدین صورت که ابتدا سیب زمینی شسته و قطعه قطعه گردید وآنگاه به همرا آب مقطر جوشانیده شد و قبل از پخت کامل و له شدن برداشته شد و از پارچه ململ عبور داده شد و دکستروز و آگار به میزانی که در بالا گفته شد به آن اضافه گردید این مخلوط در ظرف ارلن مایر یک لیتری در دستگاه اتوکلاو به مدت 20 دقیقه در فشار 2/1 اتمسفر و دمای 121 درجه سانتی¬گراد سترون گردید. اگرچه محیط کشت PDA برای جداسازی گونه¬های فوزاریوم از مواد گیاهی مناسب می¬باشد، ولی بسیاری از قارچ¬های کودرست و باکتری¬ها نیز در این محیط رشد

مطلب مرتبط :   شیعه، ابوبکر، آیات، امامت، رازی، علی(ع)