ه نگهداری شدند.<br />3-4- جمع آوری حشرات کامل یک تا سه روزه
برای تهیه¬ی حشرات کامل یک تا سه روزه¬ی سوسک چهارنقطه¬ای حبوبات، بذرهای لوبیا چشم بلبلی دارای پنجره-های شفیرگی جدا شده و در داخل شیشه¬های جداگانه¬ای قرار گرفتند. بعد از 72 ساعت حشرات بالغ یک تا سه روزه که از بذرهای لوبیا چشم بلبلی خارج شده بودند با کمک آسپیراتور جمع آوری گردیده و جهت انجام آزمایشات بعدی مورد استفاده قرار گرفتند.
3-5- تأثیر نوع مواد غذایی بر روی پارامترهای رشد و بیمارگری قارچ B. bassiana
برای بررسی احتمال تأثیر نوع مواد غذایی بر روی ویژگی¬های قارچ B. bassiana محتوای کربن و نیتروژن ماده غذایی محیط کشت تغییر داده شد تا تأثیر آنها روی پارامترهای رشدی قارچ مانند میزان رشد قطری کلونی، میزان اسپورزایی، درصد جوانه¬زنی کنیدیوم¬ها و نیز شدّت بیمارگری (LT50) آنها مورد ارزیابی قرار گیرد.
3-6- جدایه¬های قارچی و محیط¬های غذایی
چهار جدایه از قارچ B. bassiana شامل DEBI007، BEH، LRC107 و LRC137 به عنوان نماینده¬های قارچ B. bassiana در این مطالعه انتخاب و مورد استفاده قرار گرفتند. قبل از شروع این آزمایشات کنیدیوم¬های جدایه¬های انتخاب شده روی محیط کشت (SDA) Sabouroud Dextrose Agar منتقل شدند و بعد از رشد قارچ¬ها به عنوان ماده تلقیحی در آزمایشات بعدی به کار گرفته شدند. در تهیه¬ی محیط کشت SDA از پودر آماده¬ی SDA(ساخت کارخانه Merck) استفاده شد.
جدول3-1- فهرست جدایه¬های B. bassianaمورد آزمایش
جدایه میزبان مکان
DEBI007 خاک تهران-ایران
BEH خاک (مزرعه ذرت) بهشهر-ایران
LRC107 Leptinotarsa desemlineata (Say) پرتغال
LRC137 Leptinotarsa desemlineata (Say) کانادا

پنج محیط غذایی متفاوت دارای منابع متفاوت کربن و نیتروژن به شرح زیر برای انجام این تحقیق استفاده شد:
1- محیط کشت کربن: نیتروزن (35: 1): شامل چهار درصد گلوکز و یک درصد پپتون
2- محیط کشت کربن: نیتروزن (10: 1): شامل 6/0 درصد گلوکز و یک درصد پپتون
3- محیط کشت OSM (دارای فشار اسمزی بالا): شامل هشت درصد گلوکز، دو درصد پپتون و 5/5 درصد کلرید پتاسیم
4- محیط کشت فقیر از نظر مواد غذایی شامل دو درصد پپتون
5- محیط کشت فقیر از نظر مواد غذایی شامل یک درصد عصاره¬ی مخمر
عصاره¬ی مخمر و پپتون دارای منابع متفاوت کربن و نیتروژن بوده و به ترتیب دارای نسبت کربن: نیتروژن 6/3: 1 و 8: 1 می¬باشند (کاساس لوپز و همکاران، 2003). محیط کشت دارای فشار اسمزی بالا با 5/5 درصد آگار و بقیه¬ی آنها با استفاده از یک درصد آگار تهیه شدند. بعد از تهیه محیط¬های کشت در دمای 121 درجه سلسیوس و فشار 5/1 اتمسفر به مدت 20 دقیقه استریل شدند و بعد از خنک شدن آنها تا دمای حدود 45-50 درجه سلسیوس، 18 میلی-لیتر از آنها در فضای زیر هود آزمایشگاه به داخل هر کدام از پتری¬های پلاستیکی با قطر 8 سانتی¬متر ریخته شد.
3-7- اندازه¬گیری میزان رشد قطری (رشد میسلیومی) کلونی
برای این منظور یک حلقه محیط کشت حاوی قارچ به قطر 5 میلی¬متر از محیط کشت¬های مختلف دو هفته¬ای از هر کدام از جدایه¬ها برداشته شد و در وسط هر یک از محیط¬های کشت حاوی مواد غذایی مختلف قرار گرفت. اطراف هر تشتک پتری توسط پارافیلم پوشانده شد. تشتک¬های پتری در انکوباتور با دمای 1±25 درجه سلسیوس و در شرایط تاریکی نگهداری شدند. هر جدایه دارای سه تکرار از هر محیط کشت بود. قطر رشدی کلونی در فواصل سه روزه و تا روز 15 از پشت تشتک پتری بر حسب میلی¬متر اندازه¬گیری گردید. اندازه¬گیری قطر کلونی در دو جهت عمود بر هم که بیشترین رشد قطری را داشتند انجام شد و میانگین آنها به عنوان رشد قطری کلنی ثبت شد (صفوی و همکاران، 2007).

مطلب مرتبط :   سیاست، جنایی، سنتی، فقه، دینی، حقوقیکلمات کلیدی مطلبکلمات کلیدی مطلب:

3-8- اندازه¬گیری میزان اسپورزایی
برای تعیین میزان اسپورزایی هر جدایه روی هر کدام ازمحیط¬های کشت، ابتدا یک حلقه¬ی 5 میلی¬متری از بخش مرکزی هر کدام از جدایه¬ها برداشته شد و حلقه¬ی مورد نظر به داخل یک لوله آزمایشگاهی حاوی پنج میلی¬لیتر آب مقطر سترون و 02/0 درصد توین-80 منتقل گردید و بعد از بستن درب لوله آزمایش توسط نوار پارافیلم به شدت به مدت 5 دقیقه تکان داده شد تا اسپورها از روی محیط کشت جدا شده و به صورت سوسپانسیون درآیند. سپس تعداد کنیدیوم¬ها در سوسپانسیون به وسیله¬ی لام گلبول شمار یا هموسیتومتر برآورد شد (صفوی و همکاران، 2007).
3-9- آزمایش درصد جوانه¬زنی
برای تعیین درصد جوانه¬زنی اسپورها، ابتدا از قارچ¬های رشد کرده روی هر کدام از محیط¬های کشت حاوی مواد غذایی مختلف، سوسپانسیون کنیدیومی به غلظت 104 کنیدی در هر میلی¬لیتر تهیه گردید. سپس در سه نقطه از تشتک پتری حاوی محیط¬های غذایی مختلف، و در هر محل یک قطره از سوسپانسیون کنیدیومی قرار داده شد و روی هر قطره یک عدد لامل سترون قرار داده شد. تشتک¬های پتری به مدت 24 ساعت در انکوباتور با دمای 1±25 درجه سلسیوس نگهداری شدند و سپس در زیر میکروسکوپ با بزرگنمایی 40 برابر مورد بررسی قرار گرفتند. برای هر تیمار سه زمینه متفاوت میکروسکوپ و در هر زمینه تعداد 100 عدد کنیدیوم بررسی گردید. کنیدیوم¬هایی به عنوان جوانه-زده محسوب گردید که طول لوله تندش در آنها مساوی یا بزرگتر از قطر خود کنیدیوم بود (صفوی و همکاران، 2007).
3-10- تعیین شدّت بیمارگری ماده تلقیح جدایه¬های قارچ B. bassiana
بیمارگری کنیدی حاصل از محیط¬های متفاوت کشت از هر جدایه قارچی روی سوسک چهارنقطه¬ای حبوبات (Callosobruchus maculatus L.) بررسی شد. این مرحله در سه تکرار و در هر تکرار با 20 عدد حشره کامل انجام گرفت. حشرات مدّت 20 ثانیه در داخل 5 میلی¬لیتر از سوسپانسیون حاوی 107 کنیدی در میلی¬لیتر غوطه¬ور شدند و به داخل تشتک¬های پلاستیکی حاوی یک کاغذ صافی مرطوب همراه 20 گرم لوبیا چشم بلبلی قرار گرفتند. تشتک¬های پتری حاوی حشرات تیمار شده در انکوباتور با دمای 1±25 درجه سلسیوس و با شرایط تاریکی نگهداری شدند و تعداد مرگ و میر حشرات به طور روزانه تا روز 11 ثبت گردید. حشرات مرده از داخل تشتک¬های پتری خارج شده و در داخل تشتک¬های جدید حاوی کاغذ صافی مرطوب نگهداری شدند. در مواردی که رشد قارچی در سطح بدن حشرات مرده مشاهده گردید، مرگ آنها در اثر آلودگی قارچی محسوب گردید (کاسا و همکاران، 2002).

مطلب مرتبط :   صحابه، اهلکتاب، قرآن، مراجعات، ، ذهبی

3-11- تجزیه و تحلیل داده¬ها
در تمامی آزمایش¬های انجام شده از طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار استفاده شد. داده¬های مربوط به تلفات مرحله حشرات کامل سوسک چهارنقطه¬ای حبوبات ابتدا با استفاده از فرمول arcsin√xتغییر شکل یافتند. تجزیه آماری داده¬ها با استفاده از نرم¬افزار IBM SPSS Statistics 16 انجام شد. برای محاسبه [LT50] جدایه¬ها از آزمون LIFETEST در نرم¬افزار SAS Version 9.1.3 و برای مقایسه میانگین¬ها از آزمون توکی در سطح احتمال آماری پنج درصد استفاده شد.