دانلود پایان نامه
3-8-3- سنتز cDNA
برای سنتز cDNA جهت توالییابی، RNA کل استخراج شده یک نمونه ماهی نر تیمار شده با 17آلفا-استرادیول و همچنین یک نمونه ماهی ماده از ایستگاه چشمهدیمه انتخاب شد. دلیل انتخاب جنس نر، حساسیت بالاتر این جنس به حضور استروژنهای محیطی و در نتیجه افزایش بیان ویتلوژنین در نتیجه تیمار است.
حدود 500 نانوگرم از هریک از آنها با استفاده از کیت سنتز cDNA به نام کیواسکریپت ساخت شرکت کوانتا بیوساینسیز بهصورت معکوس رونویسی شد. بهطور خلاصه، واکنش با استفاده از کیو اسکریپت ریاکشن میکس (1X از غلظت نهایی) و کیواسکریپت ریورس ترنسکریپتاز (5/2X از غلظت نهایی) انجام گرفت. برنامه رونویسی معکوس شامل 5 دقیقه در C°22، 30 دقیقه در C°42 و 5 دقیقه در C°85 بود.
3-8-4- همسانهسازی cDNA نسبی ویتلوژنین در P. esfahani
آغازگرهای اختصاصی ژن ویتلوژنین از مناطق بسیار باثبات cDNA کامل سایر ماهیان استخوانی طراحی شد (جدول 3-2). PCR با استفاده از 1 واحد بیوتک DNA پلیمراز (ساخت شرکت بیولاین)، cDNA، بافر PCR شرکت سازنده (1X از غلضت نهایی)، 5/0 میکرومولار از هر یک از آغازگرهای مستقیم و معکوس، 2/0 میلی مولار dNTPs و 5/1 میلی مولار MgCl2 در حجم نهایی 20 میکرولیتر انجام شد. برنامه PCR شامل 10 دقیقه واسرشتهسازی اولیه در C°95، 35 سیکل تکثیر (واسرشتهسازی به مدت 30 ثانیه در C°95، الحاق به مدت 30 ثانیه در C°4/60 و بسط به مدت 30 ثانیه در C°72 ) و 10 دقیقه بسط نهایی در C°72 توسط دستگاه مسترسایکلر پرواس (ساخت شرکت اپندورف) بود.
محصول PCR در ژل آگارز 1% با TBE 1X رنگآمیزی شده با جل رد (ساخت شرکت بیوتیوم) اجرا و توسط سیستم کمیداک ایکس.آر.اس و به کمک نرمافزار ایمیج لب (ساخت شرکت بیورد) قابل رویت شد. محصول PCR توسط کیت نوکلئواسپین جل اند PCR کلین-آپ ( ساخت شرکت مچری-ناجل) تصفیه و به منظور توالییابی با استفاده از کیت کلونینگ توپو-تی.آ (ساخت شرکت اینویتروژن لایف تکنولوژیز) به داخل وکتورpCR®4TOPO® کلون شد. محصول این کیت برای انتقال به سلولهای Escherichia coli و سپس کشت در پلیتهای آگار LB آمپیسیلین به مدت یک شب در C°37 مورد استفاده قرار گرفت. پس از کشت 6 کلون باکتریایی در 3 میلیلیتر از محیط کشت مایع LB آمپیسیلین به مدت یک شب در شیکر C°37، با استفاده از کیت نوکلئواسپین پلاسمید (ساخت شرکت مچری-ناجل) پلاسمید استخراج شد. در هر دو کلون، هر دو رشته توسط آغازگرهای مستقیم و معکوسM13 توالییابی شد.
3-8-5- همسانهسازی cDNA نسبی بتا-اکتین در P. esfahani
به منظور حصول توالی اولیه بتا-اکتین در عروسماهی زایندهرود، از آغازگرهای مورد استفاده برای همسانهسازی نسبی ژن بتا-اکتین در Rhamdia quelen (KC195970) استفاده شد (جدول 3-2) [13]. کلیه مراحل PCR، تصفیه، همسانهسازی و توالییابی مطابق با روش بند 3-8-4 انجام گردید.
3-8-6- بسط ویتلوژنین به سمت انتهای َ3
از آنجایی که انتظار میرفت فاصله قطعه کوتاه میانی cDNA ویتلوژنین در P. esfahani تا انتهای َ3 آن بسیار طویل باشد، از استراتژی بسط این قطعه به سمت مناطقی از ژنوم که در بین بسیاری از کپورماهیان باثبات بود، استفاده شد. به این منظور، با استفاده از سه آغازگر Nested مستقیم که در انتهای َ3 قطعه ویتلوژنین میانی موجود طراحی شد و 3 آغازگر دژنره معکوس از مناطق باثبات سایر کپورماهیان بهویژه گونههایی که در بلاست قبلی قطعه ویتلوژنین میانی شباهت بیشتری را نشان داده بودند، چندین PCR انجام شد (جدول 3-2). تمام PCRها مطابق با برنامه بند 3-8-4 انجام گرفت. تنها زمان بسط به 2 دقیقه و 30 ثانیه افزایش یافت. پس از هر سه Nested PCR، قطعات در ژل آگارز 1% با TBE 1X اجرا شدند. باندهای دارای اندازه پیشبینی شده از داخل ژل بریده و با استفاده از کیت نوکلئواسپین جل اند PCR کلین-آپ تصفیه شدند. این قطعات با استفاده از کیت کلونینگ جت PCR (ساخت شرکت فرمنتاس لایف ساینسیز) به داخل وکتور pJET1.2/blunt کلون شدند.
3-8-7- تکثیر سریع دوانتهای cDNA (RACE) در ویتلوژنین
به منظور همسانهسازی انتهای َ3 در ویتلوژنین، چندین مرحله PCR با 4 آغازگر Nested مستقیم که در انتهای َ3 قطعه طویل شده آن از مرحله قبل طراحی شده بود، در مقابل آغازگرهای معکوس خارجی و داخلی پروتوکل 3’RACE کیت فرست چویش آر.ال.ام-ریس (ساخت شرکت امبیون، لایف تکنولوژیز) انجام شد. با استفاده از آداپتور 3’RACE موجود در کیت، رونویسی معکوس RNA کل صورت گرفت. شرایط PCR مشابه بند 3-8-4 بود.
برای کلون انتهای َ5 از پروتوکل 5’RACE کیت مذکور استفاده شد. در این پروتوکل بهطور خلاصه cDNA با استفاده از 1 میکروگرم RNA کل به همراه دسامرهای تصادفی موجود در کیت سنتز گردید. دو مرحله PCR با شرایط مشابه بند 3-8-4 و با استفاده از 2 آغازگر معکوس طراحی شده در انتهای َ5 قطعه cDNA میانی بهدست آمده از مراحل قبلی، انجام گرفت (جدول 3-2). در این واکنشها، آغازگرهای خارجی و داخلی َ5 موجود در کیت به عنوان آغازگر مستقیم استفاده شدند.
تمام محصولات حاصل از پروتوکلهای َ3 و َ5 در ژل آگارز 1% اجرا شدند. باندهای دارای اندازه مورد انتظار جدا و تصفیه و به منظور توالییابی با استفاده از کیت کلونینگ توپو-تی.آ به داخل وکتورpCR®4TOPO® کلون شدند.
در نهایت هر سه توالی cDNA بدست آمده (َ3، میانی و َ5) با توجه به 100% شباهت در قسمتهای دارای همپوشانی و با استفاده از یک ادغام کننده الگوریتمی (http://pro.genomics.purdue.edu/emboss/) به یکدیگر متصل شدند.
3-8-8- تکثیر سریع دوانتهای cDNA در بتا-اکتین
به منظور همسانهسازی انتهای َ3 و َ5 در بتا-اکتین، چندین مرحله PCR با 2 آغازگر Nested که در قطعه میانی آن طراحی شده بود، در مقابل آغازگرهای معکوس خارجی و داخلی پروتوکل َ3 و َ5 ریس کیت فرست چویش آر.ال.ام-ریس مطابق بند 3-8-7 انجام شد.
3-8-9- آنالیز توالیها
اطلاعات مربوط به توالیها با استفاده از نرمافزار Chromas Lite (v.2.1) (http://www.technelysium.com.au) رویت، توسط نرمافزارGeneDoc (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/) گردآوری و ادغام [75] و با استفاده از بلاست نوکلئوتید و پروتئین (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) آنالیز شد. برای ترجمه توالی از ORF به آمینواسید از ابزار ترجمه نرمافزار ExPaSy (http://web.expasy.org) استفاده شد.
3-8-10- ترسیم درخت فیلوژنی برای پروتئین ویتلوژنین در عروسماهی زایندهرود
پس از همترازی توالی پروتئینی به دست آمده از عروسماهی زایندهرود و سایر توالیهای آمینواسیدی ماهیان و برخی دیگر از مهراداران تخمگذار توسط ClustalW، آنالیزهای فیلوژنیکی و تکاملی توسط نرمافزار MEGA5 انجام گرفت [100]. تاریخچه تکامل با استفاده از روش Neighbor-Joining استنباط شد [86]. تلفیق خودکار درخت، از 1000 تکرار به دست آمد. درصد تکرار درختهایی که در آنها گروه یکسانی از تاکسونها گرد هم آمدند، در کنار شاخهها نشان داده شد [33]. این درخت بر اساس مقیاسی ترسیم گردید که در آن طول شاخهها دارای واحد یکسان با فواصل تکاملی مورد استفاده در استنباط درخت فیلوژنی است. فواصل تکاملی با استفاده از روش اصلاحی Poisson محاسبه شد [112]. این فواصل بر اساس واحدهایی از تعداد آمینواسید های جایگزین در هر جایگاه است. در این آنالیز از 57 توالی آمینواسیدی استفاده شد. تمام جایگاههایی که فاقد اطلاعات یا دارای وقفه در اطلاعات بودند، حذف شدند. مجموعه نهایی دادهها دارای 606 جایگاه متغیر آمینواسیدی بود.
3-8-11- اندازهگیری بیان ژن از طریق PCR کمی (QPCR) رونوشت معکوس
استخراج RNA کل و تعیین کیفیت و کمیت آن با استفاده از روش ارائه داده شده در بند 3-8-2 تعیین گردید. تنها نمونههایی از RNA که دارای RIN بالاتر از 7 بودند برای اندازهگیری کمی بیان ژن مورد استفاده قرار گرفتند. کمی سازی با استفاده از سایبر گرین و در دستگاه مسترسایکلر اپگرادیانت اس ریل پلکس 2 و نرم افزار Realplex software (v.2.2) (ساخت شرکت اپندورف) انجام گرفت.
در این مطالعه، به منظور نرمالسازی واریانس بین دادهها و امکان مقایسه آنها از ژن بتا-اکتین به عنوان ژن کنترل داخلی استفاده شد. با وجود اینکه واریانس بتا-اکتین تحت شرایط آزمایش ما 35/1 CT بود، نتایج بر اساس آن نرمال سازی شد.
RNA کل به روشی که قبلا در بند 3-8-3 توضیح داده شد، بهصورت معکوس رونویسی شد. سپس cDNA با استفاده از محلول 10 میلی مولار Tris-HCl و 1/0 میلی مولار EDTANa2 با pH 8.0، 10 برابر رقیق شد. واکنشهایQPCR با 10 نانوگرم از cDNA، 200 نانومولار از هر یک از آغازگرهای مستقیم و معکوس (جدول 3-2) و پرفکتا سایبر گرین فست میکس (ساخت شرکت کوانتا بیوساینسیز) انجام شد. واکنشها درون پلیتهای 10 میکرولیتری سمی-اسکرتد تواین تک Real-time PCR 96 (ساخت شرکت اپندورف) پوشیده شده با ادهسیو مسترکلیر Real-time PCR فیلم (ساخت شرکت اپندورف) انجام گرفت.
برنامه PCR شامل 5 دقیقه مرحله واسرشتهسازی اولیه و فعالسازی پلیمراز در C°95، 40 سیکل تکثیر (واسرشتهسازی به مدت 15 ثانیه در C°95، الحاق به مدت 30 ثانیه در C°60 و بسط به مدت 30 ثانیه در C°60) و منحنی ذوب نهایی به مدت 20 دقیقه ازC °60 تاC °95 بود.