دانلود پایان نامه
2-5- عصاره گیری
به منظور استحصال عصاره از نمونه هایی که در هر فصل از گونه های مختلف برداشت شده و در سایه خشک شده بود. به این صورت انجام گرفت که ابتدا 2.5 گرم از برگ های سایه خشک با نیتروژن مایع به خوبی خرد شد. سپس 50 میلی لیتر متانول 80% بر روی برگ های خرد شده موجود در یک فالکون افزوده شد. فالکون مذکور به مدت 24 ساعت روی شیکر با سرعت rpm90 قرار گرفت. پس از این مدت عصاره ها 3 بار فیلتر شد تا یک محلول زلال و شفاف به دست آمد. پس از این محلول در دمای C˚4 قرار داده شد و تست های آزمایشگاهی مربوط به تعیین میزان کل ترکیبات فنولیک و فعالیت آنتی اکسیدانی بر روی آن ها انجام شد.
2-6- اندازه گیری کل ترکیبات فنولیک
مقدار کل ترکیبات فنولیک موجود در عصاره این گیاه توسط رنگ سنجی به روش فولین- سیوکالتوکه توسط سینگلتون و راسی]102[ تغییر داده شده، مورد بررسی قرار گرفت. مقدار 5/0 میلی لیتر از عصاره استخراجی رقیق شده (1 میلی لیتر عصاره در 49 میلی لیتر متانول 80%) با 5/2 میلی لیتر از معرف فولین- سیوکالتو که 10 برابر رقیق شده بود(توسط آب مقطر) و 2 میلی لیتر از معرف کربنات سدیم 5/7 درصد به خوبی مخلوط شد و لوله های آزمایش به مدت 15 دقیقه در حمام بن ماری 45 درجه سانتی گراد قرار داده شد، سپس مقدار جذب محلول توسط دستگاه اسپکتروفتومتری در طول موج 765 نانومتر خوانده شد. مخلوطی از واکنشگر به عنوان شاهد استفاده شد. مقدار کل ترکیبات فنولیک با استفاده از معادله خط رسم شده برای اسید تانیک، بر مبنای اسید تانیک میلی گرم در گرم ماده خشک بیان گردید]105[. برای رسم منحنی استاندارد، اسید تانیک در غلظت های 5/12، 25، 50، 100 قسمت در میلیون(در متانول 80 درصد) تهیه شد و مقدار کل ترکیبات فنولیک موجود در آن به روشی که برای عصاره دکر شد تعیین گردید.
فرمول بدست آمده از منحنی استاندارد اسید تانیک:
Y=11/826X+ 0/0077
R2=0/9233
2-7- آزمون DPPH
مقدار 1/0 میلی لیتر از عصاره گیاهی یا استاندار مورد نظر (BHT) که در غلظت های 50، 100، 300 و 500 پی پی ام تهیه شده بود درون فالکون 10 میلی لیتری ریخته شد. به فالکون ها 5 میلی لیتر از محلولDPPH 1/0 میلی مولار (حل شده در متانول 80% ) افزوده گردید. سپس جذب نمونه ها در دستگاه اسپکتوفتومتر Beckman DU530 در طول موج nm 517 به منظور صفر کردن دستگاه از متانول 80% و محلول DPPH استفاده شد. کنترل موجود در این تست شامل 1/0 میلی لیتر متانول 80% و 5 میلی لیتر از محلول DPPH 1/0 میلی مولار(حل شده در متانول 80%) بود]35[. برای گزارش میزان IC50 (در واقع نشان دهنده غلظت یک ترکیب منحصر به فرد برای رفع 50 درصد DPPH است) ابتدا عدد کنترل شامل 1/0 میلی لیتر متانول 80% و 5 میلی لیتر از محلول DPPH 1/0 میلی مولار(حل شده در متانول 80%) جذب آن در دستگاه اسپکتوفتومتر BeckmanDU530 در طول موج nm517 خوانده شده و عدد بدست آمده نصف و در F(x) بدست آمده از چهار غلظت، قرار داده شد و مقدار x (میزان (IC50 محاسبه گردید]32[.
×100 درصد ممانعت کنندگی
2-8-اندازه گیری میزان پراکسید هیدروژن(H2O2)
ابتدا 8 غلظت پی پی ام ازH2O2 (0، 5، 10، 20، 30، 40، 50، 60) آماده شد و با استفاده از آن منحنی استاندار رسم گردید. سپس 1 گرم برگ تازه را با ازت مایع پودر شده و 10 میلی لیتر تری کلریک اسید( TCA) 1/0% مولار به آن اضافه شد، پس از دقائقی آن ها را در فالکون های 10 میلی لیتری انتقال داده و به مدت 15 دقیقه با دور 12000 سانتریفوژ شد. سپس 5/0 میلی لیتر از قسمت بالای محلول بدست آمده را برداشته و با 5/0 میلی لیتر محلول فسفات بافر 10 میلی مولار با pH=7/4( K2 HPO4،KH2 PO4) مخلوط می گردد. سپس 1 میلی لیتر محلول KI به آن اضافه شده و به مدت 1 ساعت در تاریکی قرار داده می شود. هنگاهی که رنگ محلول به رنگ بنفش کم رنگ در آمد آن را در طول موج nm390 قرائت می گردد]69[.
مقدار F(X)منحنی استاندارد در زیر آمده:
Y= 0/0023X -0/0002
R2=0/99
در آخر عدد قرائت شده را به جای Y قرار دادیم و مقدار X را بدست آوردیم.
2-9- مقدار مالون دی آلدهید(MDA)
سطح پراکسیده شدن لیپید های غشای سلولی به عنوان یکی از شاخص های تنش وارد شده به سلول مورد استفاده قرار گرفت. در اینجا 2- تیوباربی تیوریک اسید( TBA) ماده واکنش دهنده بود که ضریب جذب آن 155 میلی مول بر سانتی متر است. سطح پر اکسیده شدن لیپید ها به صورت نانومول بر گرم وزن تازه بیان شد. روش کار به شرح زیر بود:
ابتدا 10 گرم تری کلریک اسید(TCA) در 40 سی سی آب مقطر حل شد که نیاز به دمای 95 درجه سانتی گراد دارد. سپس 6/0 گرم TBA در 40 سی سی آب مقطر حل شد و هر دو این محلول با هم تلفیق و به حجم 100 میلی لیتر رسانیده شد. وقتی هر دو ماده کاملاً محلول شدند رنگ محلول از گچی به کرمی تغییر یافت. 1 گرم از گیاه (نمونه پاییز) با ازت مایع پودر شده، سپس 5 میلی لیتر از محلول رویی به آن اضافه شود و بعد از 1 دقیقه، به مدت 15 دقیقه در حمام بن ماری با دمای 100 درجه قرار را در داخل دستگاه سانتریفوژ به مدت 10 دقیقه، با دور rpm 5000 قرار داده شدند. از روشناور حاصل برای قرائت در سه طول موج 450، 532 و 600 نانومتر استفاده شد. برای کالیبره کردن اسپکتوفتومتر از 5 میلی لیتر محلول TBAو TCAاستفاده شد]85[.
رابطه محاسبه MDA به صورت زیر بود:
MDA=6/45(OD532-OD600) – 0/56(OD450) ×1000
OD= جذب در 450، 532 و 600 نانومتر
1000= ضریب تبدیل میلی مول به نانومول
2-10- اندازه گیری نشت الکترولیت
به منظور محاسبه شاخص پایداری غشاء، 200 میلی گرم از برگ های جدا شده از هر واحد آزمایشی( نمونه زمستان) داخل دو سری لوله آزمایش حاوی 10 میلی لیتر آب دو بار تقطیر شده قرار گرفت . سپس یک سری نمونه ها در دستگاه بن ماری در دمای 40 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه قرار داده شده (EC1) و سپس در این زمان به کمک دستگاه ECمتر هدایت الکترولیت نمونه ها اندازه گیری شد. سپس، سری دوم از لوله های آزمایش را در بن ماری در دمای 100 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه گذاشته)2EC) و پس از سرد شدن هدایت الکترولیتی آن ها اندازه گیری شد و در نهایت با استفاده از اعداد حاصل و از طریق فرمول زیر شاخص پایداری غشاء محاسبه گردید]92[.
100 × = شاخص پایداری غشاء( % نشت یونی)