دانلود پایان نامه
ب- میانگین غلظت هموگلوبین ذرهای (MCHC)
این شاخص غلظت هموگلوبین در توده یاختههای قرمز را بر حسب درصد نشان میدهد.
(3-7)
در این رابطه، Hb میزان هموگلوبین (بر حسب گرم در دسیلیتر) و HCT میزان هماتوکریت را نشان میدهد [4].
ج- میانگین هموگلوبین ذرهای (MCH)
این شاخص متوسط هموگلوبین در یک یاخته قرمزخون را بر حسب پیکوگرم نشان میدهد.
(8-3)
در این رابطه، Hb میزان هموگلوبین (بر حسب گرم در دسیلیتر) و RBC(بر حسب میلیون در میلیمتر مکعب) را نشان میدهد [4].
3-5- تعیین سن
برای تعیین سن از روش آناتومیکی (فلس) استفاده شد. اساس کار در این روش تغییرات دوره ای است که در رشد سالانه ماهی روی می دهد.در این بررسی سن ماهیان با استفاده از بررسی دوایر سنی موجود روی فلس های برداشت شده از ناحیه بین خط جانبی و جلو باله پشتی انجام شد. رشد فلس متناسب با رشد ماهی است. همزمان با رشد فلس، حلقههای رشد سالیانه در حاشیه فلس تشکیل می شود. حلقه های رشد، یک الگوی متحدالمرکز است که مرتبط با شرایط محیطی و رشد در طی یک سال تشکیل می شود. به کمک این حلقه ها می توان سن ماهی را تعیین کرد [88]. برای زایل نمودن مواد لزج موکوسی روی فلس، شستشوی آن با آب گرم و محلول های تمیز کننده مانند مایع ظرفشویی و سپس آب مقطر انجام شد. فلس های آماده شده به کمک میکروسکوپ مطالعه گردید.
3-6- محاسبه شاخص توسعه گنادی (GSI)
پس از تعیین جنسیت، گنادها به طور کامل خارج و برای محاسبه GSI با دقت 01/0 گرم وزن گردید. این شاخص به صورت زیر محاسبه می گردد [17]:
(3-9)
در این رابطه برابر با وزن گناد و برابر با وزن بدن ماهی است.
3-7- تهیه بافت گناد
در این مطالعه، بخش میانی گناد تعداد 5 قطعه ماهی ماده و 5 قطعه ماهی نر از هر ایستگاه بهطور تصادفی انتخاب و به منظور انجام مطالعات بافت شناسی در فرمالین 10% قرار داده شد. سپس نمونه ها از مراحل آبگیری از طریق الکل با درجات مختلف، شفاف سازی با استفاده از گزیلول، پارافینه کردن، قالب گیری، برش و رنگ آمیزی به روش استاندارد هماتوکسیلین-ائوزین عبورداده شد. پس از رنگآمیزی با استفاده از میکروسکوپ نوری مرحله توسعه گنادی در جنس نر و ماده مورد شناسایی قرار گرفت [71].
3-8- آمادهسازی نمونهها جهت مطالعات مولکولی و اندازهگیری بیان ژن ویتلوژنین
بررسی های مولکولی شامل توالییابی ژن کدکننده ویتلوژنین و بررسی بیان آن، در طی دوره فرصت مطالعاتی تحت نظر پروفسور گنزالو مارتینز-ردریگز در مرکز علوم دریایی اندلوسیا، کادیز، اسپانیا اجرا گردید. در تمام پروتوکلها شامل کیتهای تجاری مورد استفاده، دستورالعمل شرکت سازنده دنبال شد. تمام آغازگرها از شرکت اینتگریتد DNA تکنولوژیز (کشور بلژیک) خریداری شد. توالییابیها با روش Dideoxy و توسط شرکت بیوتکنولوژی کمپانی (بیواری) انجام گردید.
3-8-1- نمونهبرداری و تیمار
در این مطالعه حدود 30 میلیگرم از کبد تعداد 5 قطعه ماهی ماده و 5 قطعه ماهی نر از هر ایستگاه به منظور انجام مطالعات مولکولی در تیوبهای 5 میلیلیتری حاوی محلول محافظتکننده از RNA (ساخت شرکت فیت بیوتکنولوژی) قرار داده شد و برای استخراج RNA کل در دمای C°20- قرار گرفت.
از آنجاییکه برای اندازهگیری میزان بیان هر ژن داشتن آغازگرهای اختصاصی در همان گونه الزامی است و توالی ژن ویتلوژنین و بتااکتین عروسماهی زایندهرود تاکنون در بانک جهانی ژن به ثبت نرسیده است، لازم بود توالییابی و همسانهسازی این دو ژن برای اولین بار در این گونه صورت پذیرد. از سوی دیگر با وجود ثبات نسبی ژن ویتلوژنین در بین ماهیان، به دلیل وجود ایزوفرمهای متعدد این ژن، به منظور جلوگیری از خطا در زمان اندازهگیری بیان ژن و ایجاد محصولات جانبی در واکنشهای زنجیرهای پلیمراز (PCR)، توالییابی کامل این دو ژن انجام گردید و سپس آغازگرهای مناسب برای انجام Real-time PCR از روی آن طراحی شد.
با توجه به اینکه نمونهبرداری در زمان مورد انتظار برای بالا بودن بیان ژن ویتلوژنین صورت نگرفته بود، گروهی از ماهیان پس از صید به مدت 24 ساعت تحت تیمار 2000 نانوگرم 17بتا-استرادیول/ لیتر قرار گرفتند تا بیان این ژن به میزان کافی برای ساخت cDNA اختصاصی افزایش یابد [29]. کبد آنها به تفکیک جنسیت در تیوبهای حاوی محلول محافظتکننده از RNA و تا زمان استخراج RNA در دمای C°20- قرار گرفت.
3-8-2- استخراج و تعیین کمیت و کیفیت RNA
در تمام نمونهها، RNA با استفاده از کیت نوکلئواسپین RNA II ساخت شرکت مچری-ناجل استخراج شد و هضم DNA بر روی ستون و با استفاده از آنزیم DNase فاقدRNase موجود در کیت انجام گرفت.
کمیت RNA به روش اسپکتروفتومتری در طول موج 250 نانومتر توسط دستگاه بیوفتومترپلاس ساخت شرکت اپندورف مورد بررسی قرار گرفت. به علاوه کیفیت تقریبی آن از طریق دو شاخص که از رابطه میزان جذب نوری در 260 نانومتر/ 280 نانومتر و همچنین 260 نانومتر/ 230 نانومتر بهدست میآید و مستقیما توسط دستگاه محاسبه میشود، مورد ارزیابی قرار گرفت. حداکثر جذب نوری توسط RNA در 260 نانومتر صورت میگیرد. درحالیکه پروتئین دارای حداکثر جذب نوری در 280 نانومتر است. بنابراین نسبت جذب نوری در 260 نانومتر/ 280 نانومتر شاخص مناسبی برای ارزیابی آلودگیهای پروتئینی است. چنانچه مقدار این شاخص در دامنه 2-8/1 قرارگیرد، کیفیت RNA مناسب ارزیابی میگردد. برای بررسی بیشتر کیفیت RNA از نسبت جذب نوری 260 نانومتر/ 230 نانومتر استفاده میشود. اما بر خلاف شاخص نسبت میزان جذب نوری در 260 نانومتر/280 نانومتر که بیشتر تحت تاثیر آلایندههای پروتئینی و نوکلئوتیدی تغییر میکند، این شاخص تحت تاثیر تعداد بیشتری از آلایندهها قرار دارد و در نتیجه از دقت کمتری برخوردار است. چنانچه مقدار این شاخص در دامنه 2-7/1 قرارگیرد، کیفیت RNA مناسب ارزیابی میشود [76].
برای بررسی دقیقتر کیفیت RNA از دستگاه بیوآنالیزور 2100 و کیت RNA نانو 6000 ساخت شرکت اجیلنت تکنولوژیز، لایف ساینسیز استفاده شد. این دستگاه با استفاده از شاخصی به نام RIN کیفیت RNA را نمایش میدهد. این شاخص به منظور استانداردسازی فرایند تفسیر صحت RNA و حذف تفسیرهای شخصی از کیفیت RNA ابداع شده است که روش ازریابی به روش الکتروفورز نیز در آن مدنظر قرار میگیرد. این روش چون بر مبنای تعیین چشمی نسبت ریبوزومی (که از تقسیم زیرواحدهای 18S به 28S به دست میآید) از روی ژل حاصل از الکتروفورز ایجاد میشود، معمولاً با خطا همراه است. در صورتیکه نرمافزار الگوریتمی RIN، علاوه بر اینکه این شاخص را به صورت خودکار تعیین میکند، یک سیستم نمرهدهی از 1 تا 10 ارائه میدهد که در آن 10 دارای بهترین و 1 دارای بدترین کیفیت RNA است (شکل 3-6) [73].