دانلود پایان نامه
3-4- فراسنجههای خونی
بلافاصله پس از صید اقدام به بیهوشی ماهیان و خونگیری از طریق ساقه دمی و با استفاده از سرنگ آغشته به EDTA 5/0% شد (شکل 3-4). نمونههای خونی درکوتاهترین زمان و در دمای کمتر از چهار درجه سانتیگراد جهت بررسیهای زیر به آزمایشگاه شیلات دانشکده منابع طبیعی منتقل شد.
3-4-1- اندازهگیری هموگلوبین
برای اندازهگیری هموگلوبین (Hb) از روش سیانوهموگلوبین استفاده شد. در این روش به میزان 20 میکرولیتر نمونه خون مقدار 5 میلیلیتر محلول درابکین افزوده میشود. این محلول حاوی سیانید پتاسیم است. طی واکنشی، سیانید پتاسیم مت هموگلوبین را به سیان مت هموگلوبین تبدیل میکند. این ماده دارای جذب حداکثر در 540 نانومتر است. مقدار جذب نوری توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازهگیری و در نهایت با منحنی استاندارد تعیین هموگلوبین مقایسه میگردد [4].
شکل3-4) خونگیری از ساقه دمی عروسماهی زایندهرود [نگارنده].
3-4-2- اندازهگیری هماتوکریت
هماتوکریت (HCT) روشی برای اندازهگیری حجم تودهای یا ذرهای یاختههای قرمز نسبت به حجم کل خون است که بر حسب حجم گلبول قرمز در 100 میلیلیتر خون بیان میشود. برای اندازهگیری هماتوکریت، لولههای موئینه میکروهماتوکریت را به ماده ضد انعقاد آغشته و با نمونه خون تماس داده شد تا لوله از خون پر شود. پس از اینکه سه چهارم لوله از خون پر شد، سر لوله با انگشت و سپس با خمیر مخصوص مسدود شد. سپس این لوله به داخل سانتریفیوژ میکروهماتوکریت منتقل و به مدت 5 دقیقه با سرعت حداقل 7000 دور بر ثانیه سانتریفیوژ و درصد هماتوکریت با استفاده از خطکش مخصوص قرائت شد [4، 48].
3-4-3- شمارش گلبولهای قرمز
در پزشکی جهت شمارش گلبولهای قرمز خون (RBC) از دستگاههای خودکار شمارنده سلول استفاده میشود. اما در ماهیان به دلیل اندازه بزرگ و هستهدار بودن اریتروسیتها امکان استفاده از این دستگاهها وجود ندارد. بنابراین به این منظور از لام هموسیتومتر نئوبار استفاده میشود. اما چون تراکم سلولهای خونی بالاست و امکان روی هم افتادگی این سلولها وجود دارد و نیز جهت تفکیک سلولهای مختلف از یکدیگر، عمل رقیق سازی خون انجام میشود. برای رقیق سازی یاختههای قرمز خون از پیپت ملانژور قرمز استفاده میشود. برای استفاده از این نوع پیپت، تا درجه 5/0 آن از خون و بقیه حجم لوله تا درجه 101 از محلول رقیق کننده پر میشود (رقت یک دویستم). در این مطالعه از محلول رقیق کننده Dace استفاده شد. محلول Dace از ترکیب 1/0 گرم ترکیب بریلیانت کریزل بلو، 8/3 گرم سدیم سیترات و 2/0 میلیلیتر فرمالدهید 37% در 100 میلیلیتر آب مقطر ایجاد می شود [30]. پس از قرار دادن لامل روی لام هموسیتومتر، سه تا چهار قطره از مایع درون پیپت را تخلیه شد تا در فاصله بین آن دو جریان یافته و حجره لام را پرکند. لام در زیر میکروسکوپ قرار گرفت و یاختههای قرمز موجود در 5 مربع کوچک از 25 مربع مرکزی با لنز 40 شمارش شد (شکل 3-5). برای محاسبه تعداد گلبولهای قرمز در هر میلیمتر مکعب خون با رقت یک دویستم از رابطه ذیل استفاده شد:
(3-2)
(3-3)
در این رابطه N مجموع تعداد یاختههای قرمز شمارش شده در یک میلیمتر مکعب، n مجموع تعداد یاختههای قرمز شمارش شده در 5 مربع کوچک، S مساحت 5 مربع (یک پنچم مترمربع)، h ارتفاع هر مربع (1/0 میلیمتر) و d رقت خون در محلول رقیق کننده (یک دویستم) را نشان میدهد [4].
3-4-4- شمارش گلبولهای سفید
به دلیل تراکم کمتر سلولهای سفید خون (WBC) نسبت به یاختههای قرمز، رقیق سازی با رقت کمتری صورت میگیرد. به این منظور از پیپت ملانژور سفید استفاده میشود. برای استفاده از این نوع پیپت، تا درجه 5/0 آن از خون و بقیه حجم لوله تا درجه 11 از محلول رقیق کننده ریس پر میشود (رقت یک بیستم). سپس همانند روش توضیح داده شده، سه تا چهار قطره مایع درون پیپت را تخلیه شد تا در فاصله بین آن دو جریان یابد و حجره لام را پرکند. لام در زیر میکروسکوپ قرار گرفت و یاختههای سفید موجود در چهار مربع کوچک که در چهار گوشه مربع بزرگ قرار دارند با لنز 20 شمارش شد (شکل3-3). برای محاسبه تعداد گلبولهای قرمز در هر میلیمتر مکعب خون با رقت یک دویستم از رابطه ذیل استفاده شد:
(3-4)
(3-5)
در این رابطه N مجموع یاختههای سفید شمارش شده در یک میلیمتر مکعب، n مجموع تعداد یاختههای سفید شمارش شده در چهار4 مربع، S مساحت چهار مربع (چهار میلیمترمربع)، h ارتفاع هر مربع (1/0 میلیمتر) و d رقت خون در محلول رقیق کننده (یک بیستم) را نشان میدهد [4].
شکل 3-5) لام هماسیتومتر [4].
3-4-5- شمارش افتراقی گلبولهای سفید
تهیه گسترش خونی به روش دولامی انجام گرفت. در این روش یک لام به عنوان گسترش دهنده و لام دیگر که قطره خون روی آن قرار میگیرد، لام گسترش نام دارد. پس از ایجاد گسترش خونی، جهت جلوگیری از تغییرشکل یاختهها، تاثیر میکرواورگانیسمها و کاهش کیفیت، لام گسترش بلافاصله با متانول 95% تثبیت و سپس خشک میگردد. سپس به مدت 10-30 دقیقه با محلول گیمسا رنگآمیزی و با آب شستشو و خشک میشود. این محلول با داشتن اجزاء اسیدی و بازی، قسمتهای مختلف هر نوع سلول را به رنگ مشخصی رنگامیزی میکند و به این صورت سلولها قابل تشخیص و شمارش میگردند. برای تهیه محلول گیمسا ابتدا 1 گرم پودر گیمسا با 50 میلیلیتر گلیسرول همراه با یک هم زن مغناطیسی به مدت 1 ساعت در 60 درجه سانتی گراد حرارت داده شد. بعد از سرد شدن این ترکیب، 50 میلیلیتر متانول به آن اضافه و با کاغذ صافی فیلتر شد. این استوک با استفاده از آب شهری تا 10% رقیق شد و برای رنگ آمیزی گسترشها مورد استفاده قرار گرفت. درهرگسترش تعداد 100 عددگلبول سفید به صورت تصادفی شمارش و درصد فراوانی آنها محاسبه شد [19].
3-4-6- شاخصهای ثانویه خونشناسی
شاخصهای ثانویه خونشناسی برای توصیف اندازه سلولها و میزان هموگلوبین آنها بهکار میرود [4].
الف- حجم متوسط گویچه قرمز (MCV)
این شاخص حجم متوسط هر یاخته قرمز خون را نشان میدهد. این شاخص بر حسب فمتولیتر محاسبه میشود. هر فمتولیتر برابر یک میکرومتر مکعب است.
(3-6)
در این رابطه، HCT میزان هماتوکریت و RBC تعداد یاختههای قرمز خون (بر حسب میلیون در میلیمتر مکعب) را نشان میدهد [4].