می¬کنند، لذا مانع جداسازی قارچ فوزاریوم می¬شوند، از این رو در محیط کشت PDA از آنتی¬بیوتیک¬های مناسبی چون تتراسایکلین استفاده گردید و سعی شد غلظت¬های سیب زمینی و دکستروز به نصف تقلیل یابد [13]. ضمناً به علّت جهش¬هایی که در این محیط کشت صورت می¬گیرد (کم شدن قدرت بیماری-زایی) به منظور نگه¬داری طولانی مدّت جدایه¬ها این محیط کشت مورد استفاده قرار نگرفت [71].<br />3-3-1-2- محیط کشت پپتون-پنتاکلرونیتروبنزن-آگار
PPA دارای یک محیط پایه است که بعداً آنتی¬بیوتیک و قارچ¬کش به آن افزوده می¬گردد و یک محیط اختصاصی برای جداسازی گونه¬های مختلف فوزاریوم از خاک می-باشد [67]. این محیط از رشد قارچ¬ها و باکتری¬ها ممانعت به عمل می¬آورد و به صورت انتخابی برای جداسازی گونه¬های مختلف فوزاریوم از خاک و بافت¬های آلوده مورد استفاده قرار می¬گیرد، طرز تهیه محیط کشت پایه PPA برای حجم یک لیتر به شرح زیر می-باشد:
جدول 3-2- اجزای تشکیل¬دهنده محیط کشت پپتون-پنتاکلرو نیترو بنزن-آگار
مقدار ماده
gr20 Agar
gr15 Peptone
gr1 KH2PO4
gr5/0 MgSO4.7H2O
gr1 (حاوی 075/0 مادۀ (PCNB Terrachlor
محیط کشت را تهیه و اتوکلاو کرده و زمانی که دمای محیط کشت به 55 درجه سانتی¬گراد رسید، آنتی¬بیوتیک-های استرپتومایسین به میزان 1 گرم و نئوماسین به میزان 12 گرم اضافه شد، از PPA برای نگه¬داری طولانی استفاده نشد چون پپتون موجود درآن منجر به تجمع سم آمونیوم می¬شود. (توضیح آنکه استرپتومایسین علیه باکتری¬های گرم منفی و نئومایسین برای جلوگیری از عمل باکتری¬های گرم مثبت به کار می¬روند) [13].
3-3-2- محیط کشت¬های خالص¬سازی
3-3-2-1- محیط کشت آب-آگار
آب-آگار20% را از اختلاط 20 گرم آگار در 1 لیتر آب مقطر و سپس سترون کردن آن در اتوکلاوبه مدت 20 دقیقه در فشار 5/1 اتمسفر و دمایᵒc121تهیه کردیم، آب-آگار محیطی مناسب جهت جوانه زدن کنیدی¬های قارچ و نیز تولید یک کلنی است لذا برای تک¬اسپور کردن و تهیه نوک¬هیف قارچ استفاده شد [13].
3-3-3-محیط کشت¬های شناسایی
3-3-3-1-محیط کشت برگ میخک-آگار
CLAیک محیط طبیعی است، برای تهیّه این محیط کشت تکّه¬های کوچک برگ میخک، از برگ¬های تازۀ گیاه میخک که عاری از بقایای علف¬کش¬ها و قارچ¬کش¬ها بودند استفاده شد، برای این منظور بلافاصله بعد از جمع-آوری برگ¬های گیاه، آن¬ها را قطعه¬قطعه کرده (mm8-5) و در آون در حرارت ᵒc 70 به مدّت3 تا 4 ساعت نگه داشته شد تا خشک و شکننده گردیدند سپس برگ¬ها در یک ظرف درب¬دار سترون در یخچال نگه¬داری شد (این برگ¬ها به مدت 12 ماه در درجه حرارتᵒc 5-2 قابل مصرف¬اند). برای تهیه محیط کشت مذبور آب-آگار02/0 تهیه گردید سپس در پتری ریخته و قطعات برگ میخک سترون را به آن اضافه کرده، بعد از 24 ساعت قارچ را در داخل پتری و در مجاورت برگ میخک کشت داده شد. از مزایای این محیط کشت آن است که ماکرو کنیدی¬ها روی برگ میخک و در داخل اسپوردوشیوم تشکیل می¬شوند، این نوع ماکروکنیدی¬ها در شناسایی گونه¬ها به کار می¬روند زیرا در مقایسه با کنیدی-هایی که روی ریسه¬های موجود در سطح آگار از فیالیدهای انفرادی تشکیل می¬شوند دارای اندازه ثابت¬تری هستند [13].
3-3-3-2- محیط کشت مواد غذایی خاص
به منظور تهیه این محیط کشت، ترکیبات عنوان شده در زیر (جدول 3-3) به یک لیتر آب مقطر اضافه شد و سپس مشابه سایر محیط کشت¬های گفته شده سترون گردید.

جدول 3-3- مواد تشکیل دهنده محیط کشت مواد غذایی خاص
مقدار ماده
gr1 KH2PO4
gr1 KNO3
gr5/0 MgSO4.7H2O
gr5/0 KCL
gr5/0 Glucose
gr2/0 Sucrose
gr20 Agar-Agar

از این محیط کشت به منظور تشکیل اسپوردوشیوم و نهایتاً تولید ماکروکنیدی¬ها که برای شناسایی حائز اهمیت¬اند استفاده می¬شود و به دلیل فقیر بودن از لحاظ مقدار قند، تغییرات یا جهش به حداقل می¬رسد، با استفاده از این محیط کشت جدایه¬های بدست آمده را می¬توان به مدّت حدود یک سال نگه¬داری کرد [70].
3-4-شناسایی قارچ عامل بیماری
شناسایی قارچ F. oxysporum بر اساس مشخصات قارچ در محیط کشت¬های شناسایی قارچ اعم از محیط CLA و SNA انجام گرفت [63]. این مشخصات شامل شکل ماکروکنیدی¬ها، میکروکنیدی¬ها، تعداد کلامیدوسپور¬ها و از همه مهم¬تر شکل فیالید¬ها بود، در این قارچ ماکروکنیدی¬ها قایقی شکل، کلامیدوسپورها به صورت تکی یا زنجیره¬های دوتایی و فیالیدها به شکل کوتاه و بدون انشعاب¬اند [63].
تشخیص این گونه از F. solani کمی مشکل است اما وجود فیالیدهای کوتاه، این گونه را از F.solani که فیالیدهای طویل تولید می¬کند متمایز می¬سازد [13]. به منظور شناسایی جنس و گونه¬های عامل این بیماری از کتاب The fusarium laboratory manual استفاده شد [63].
3-5- تهیه کشت خالص و نگه¬داری جدایه¬ها
به منظور نگه¬داری قارچ عامل بیماری، کشت خالص هر یک از جدایه¬ها به دو روش تک اسپور کردن و نوک هیف کردن بدست آمد.
3-5-1- روش تک اسپور کردن
برای تهیۀ کشت تک اسپور هر جدایه قارچی ابتدا مقادیری از قارچ حاوی اسپور با استفاده از سوزن سترون برداشته شد و در داخل لوله سترون حاوی آب -مقطر سترون سوسپانسیون اسپور تهیه گردید سپس این سوسپانسیون تهیه شده چندین بار رقیق¬سازی گردید از این سوسپانسیون مقدار 200-100 میکرولیتر به محیط کشت حاوی آب-آگار02/0 منتقل شدند، تشتک¬های پتری در دمای ᵒc25 در انکوباتور با تناوب نوری 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی جهت تحریک جوانه¬زنی اسپور نگه¬داری شدند، بعد از مدت زمان دو روز با استفاده از استریومیکروسکوپ اسپور¬های جوانه زده مشخص و با سوزن سترون و در کنار شعله چراغ الکلی یک نمونه از تک اسپور¬های جوانه زده شده از محیط کشت جدا شده و به تشتک پتری حاوی محیط کشت PDA منتقل شد تشتک¬های حاوی نمونه¬های تک اسپور شده در انکوباتور در دمای ᵒc25 در تناوب نوری 12 ساعت تاریکی و روشنایی جهت تشکیل پرگنه¬های خالص قارچ نگه¬داری گردیدند.
3-5-2- روش نوک¬هیف
از این روش به منظور خالص¬سازی جدایه¬هایی که فاقد اسپور بودند استفاده گردید، بدین صورت که ابتدا از محیط کشت¬هایی که فاقد اسپور بودند توسط اسکالپل چند تکّه برداشته شد و در تشتک¬های پتری حاوی محیط کشت آب-آگار 02/0 قرار داده شد، پس از مدت زمان 48-24 ساعت نگه¬داری در تشتک¬های حاوی محیط کشت آب-آگار مورد بررسی قرار گرفتند و یک نوک هیف از هر تشتک پتری برداشته شد و به محیط کشت PDA منتقل گردید.
3-5-3- نگه¬داری کشت خالص قارچ
برای نگه¬دای کشت¬های خالص قارچی از دو روش، نگه-داری در لوله آزمایش و نگه¬داری بر روی کاغذ صافی استفاده شد. در روش نگه¬داری در لوله محیط کشت PDA درون لوله¬ها ریخته شد و لوله¬ها درون اتوکلاو در دمای 121 درجه و فشار 5/1 اتمسفر در مدّت زمان 20 دقیقه سترون و سپس لوله¬ها از اتوکلاو خارج و در یک سطح شیب¬دار قرار داده شدند، پس از آنکه محیط PDA داخل لوله¬ها بسته شد، در زیر هود بیولوژیک در شرایط سترون مقداری از ریسه قارچ خالص را در ته هر لوله قرار دادیم و به ازای هر جدایه سه لوله برای نگه¬داری استفاده کردیم سپس لوله¬ها درون انکوباتور در دمای ᵒc25 قرار داده شدند. بعد از رشد کافی قارچ، لوله¬ها به یخچال در دمای ᵒc4 منتقل شدند. در روش نگه¬داری بر روی کاغذ صافی جدایه¬های قارچ خالص بر روی کاغذ صافی برده¬شد، پس از رشد قارچ روی کاغذ صافی¬های سترون، کاغذ صافی¬های حاوی قارچ از روی محیط کشت برداشته شده و خشک گردیدند، سپس کاغذ¬ها برای نگه¬داری درون میکروتیوپ¬های 5/1 سی¬سی قرار داده شدند در اینجا نیز همانند روش پیشین هر جدایه در سه میکروتیوپ نگه¬داری شد.
3-6- محلول¬های رنگی مورد استفاده برای رنگ-آمیزی و مشاهدۀ قارچ
3-6-1- محلول اریتروزین
3 گرم اریتروزین به 100 سی¬سی هیدروکسید آمونیوم010/0 اضافه شد و صاف گردید از این معرف قارچی جهت رنگ¬آمیزی و اندازه¬گیری اندام¬های قارچی، از جمله ابعاد ماکروکنیدی¬ها و میکروکنیدی¬ها استفاده گردید.
3-6-2- محلول آبی پنبه در آب
این محلول به نسبت 01/0جرمی-حجمی با آب مخلوط و سپس صاف گردید، از این معرف رنگی به منظور رنگ-آمیزی و اندازه¬گیری اندام¬های قارچی، استفاده شد.
3-7-بررسی آزمون بیماری¬زایی در گلخانه
به منظور انجام تست بیماری¬زایی ابتدا مایه تلقیح قارچ تهیه گردید، که برای این منظور از بذر گندم استفاده شد، ابتدا مقدار 150 گرم بذر گندم به مدت 24 ساعت در آب مقطر خیسانده و سپس به مدت 20 دقیقه در دمای 121 درجه و فشار 2/1 اتمسفر در اتوکلاو سترون گردید، بذور سترون شده پس از سرد شدن به اتاق کشت منتقل گردید و در این مرحله توسط دیسک¬های2-1 سانتی¬متری از محیط کشت قارچی هفت روزه مایه¬زنی و ارلن حاوی بذور مایه¬زنی شده به انکوباتور در دمای 25 درجه نگه¬داری شد و هر روز به منظورمخلوط شدن بهتر بذر و قارچ تکان داده شد.
برای انجام آزمون بیماری¬زایی از خاک مزرعه استفاده گردید، خاک در دمای 121 درجه سانتی¬گراد با فشار 1 اتمسفر در اتوکلاو سترون شد، سپس بذور نخود پس از ضدعفونی سطحی با هیپوکلریت سدیم 5/0 درصد در مدت زمان 2-1 دقیقه و سه بار شستشو با آب مقطر سترون، در گلدان و در عمق 3 سانتیمتری خاک کشت گردید جهت مایه¬زنی قارچ ، در مرحله گیاهچه خاک اطراف ریشه¬ها به آرامی کنار زده شد و بذور گندم تلقیح شده با قارچ در پای ریشه¬ها ریخته شد. علائم به صورت زردی و پژمردگی 20 روز پس از کشت بذر مشاهده گردید.
3-8-آزمایش¬های مولکولی
تمامی آزمایشات مولکولی این پایان¬نامه در آزمایشگاه بیماری¬شناسی گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه ایلام انجام گرفته است.
3-8-1-استخراج DNA
جهت تولید میسیلیوم به منظور استخراج DNA، ازمحیط کشت مایع سیب¬زمینی-دکستروز استفاده گردید. برای این امر ابتدا به ارلن¬های 250 میلی¬لیتری حاوی 100 میلی لیتر محیط کشت مایع چند بلوک میسیلیومی از محیط کشت جامد قارچ اضافه گردید و بعد از بستن در ارلن¬ها توسط فویل وپنبه سترون به دستگاه شیکر-انکوباتور با دمای ᵒc25 و 90 دور در دقیقه انتقال داده شد. بعد از مدت زمان 5 روز ریسه¬های قارچ با استفاده از قیف بوخنر و پمپ خلأ از محیط کشت مایع جداسازی گردید و بعد از ریختن ریسه¬های جمع¬آوری شده در ویال، ویال¬ها برای مصارف بعدی در فریز با دمای ᵒc20- نگه¬داری گردیدند. برای استخراج DNA قارچ از روش CTAB استفاده شد، بافر تجزیه با ترکیبی که در زیر آمده تهیه گردید (جدول 3-4).

مطلب مرتبط :   نفت، بریتانیا، انگلیس، دریایی، بانک، شاهنشاهی

جدول 3-4- ترکیبات استفاده شده در بافر استخراج DNA
غلظت مواد
02/0 CTAB
mM20 EDTA
M4/1 NaCL
mM100 Tris-HCL
2/0% 2-mercaptoethanol

به منظور تهیه بافر استخراج ابتدا 4 ماده اول را که از قبل درست و همه را سترون کردیم با هم مخلوط نموده و در مرحله پایانی ماده آخر یا همان 2-مرکاپتواتانول را اضافه نمودیم سپس با استفاده از آب مقطر سترون به حجم رسانیدیم.
جهت نگه¬داری طولانی مدّت DNA از بافرTE استفاده شد که با اختلاط مواد زیر تهیه گردید.
Tris-HCL PH: 8 100mM
EDTA PH: 8 20mM
3-8-1-1-مراحل استخراج DNA
به منظور استخراج DNA از روش CTAB با کمی تغییرات استفاده گردید[42].
-توده میسیلیومی قارچ به میزان 150-50 میلی¬گرم وزن شد و درون هاون¬های چینی سترون آسیاب شد، سپس با 700 میکرولیتر بافر استخراج که از قبل گرم شده بود (دمای 60 درجه سانتی¬گراد) اضافه نموده و به طور کامل مخلوط گردید. مخلوط به¬دست آمده به ویال-های 5/1 میلی¬لیتری سترون منتقل گردید. سپس ویال¬ها در حمام آب گرم با دمای 60 درجه سانتی¬گراد به مدّت 30 دقیقه تا 2 ساعت قرار داده شد و در این مدّت هر 5 دقیقه یک¬بار ویال¬ها وارونه شدند.
-بعد از این مدّت زمان نمونه¬ها از حمام آب خارج شد، سپس 700 میکرولیتر محلول کلروفرم ایزوآمیل الکل(24:1) به هرکدام از ویال¬ها اضافه شد و به¬مدّت 10-5 دقیقه بصورت ملایم و یکنواخت مخلوط گردید سپس نمونه¬ها به سانتریفوژ منتقل شد و با دور 12000 دور به¬مدّت 20 دقیقه سانتریفوژگردید.
-در این مرحله در هر ویال 3 فاز تشکیل شد، فاز شفاف رویی که حاوی DNA ژنومی بود به ویال¬های سترون دیگر منتقل شد، سپس با افزودن آنزیم RNase به¬مقدار 20 میکروگرم در میلی¬لیتر به نمونه¬ها، ویال¬ها به مدّت 30 دقیقه به حمام آبی با دمای ᵒc37 منتقل گردید.
-بهDNA استخراج شده 70 میکرولیتر سدیم استات و 400 میکرولیتر ایزوپروپانول سرد اضافه و سپس ویال¬ها در فریزر دمای ᵒc20- به مدّت 60-30 دقیقه نگه¬داری شد.
-نمونه¬ها به منظور رسوب دادن DNA استخراج شده به مدّت 10 دقیقه با دور 12000 دور در دقیقه سانتریفوژ شدند.
-فاز روئی دور ریخته شد و DNA رسوبی با 500 میکرولیتر اتانول 70 درصد شستشو داده شد.
-به منظور جدا کردن الکل نمونه¬ها به مدّت 1 دقیقه با دور 12000 دور در دقیقه سانتریفوژ شد.
-پس از خالی کردن ویال¬ها از الکل رسوب DNA به مدّت 20 دقیقه در دمای اتاق خشک گردید به طوری که هیچ گونه الکلی در ته ویال باقی نماند.
-در مرحله پایانی به منظور نگهداری طولانی مدّت رسوب DNA 100 میکرولیتر TE(PH:8) به هر کدام از نمونه¬ها اضافه گردید.
3-8-2- بررسی کیفیت استخراج DNA
به منظور بررسی کیفیت DNA ژنومی استخراج شده از دستگاه الکتروفورز افقی

مطلب مرتبط :