عمل جوانه زنی از یک طرف یا دو طرف مخمر منجر به ایجاد مجموعه هایی از سلول¬های متصل به هم می¬شود و نهایتاً اشکال خوشه¬مانند بنام بلاستوکونیدی یا بلاستوسپور را می-سازد. گاه در نتیجه¬ی رشد و طویل شدن برخی جوانه¬ها، اشکال هایف¬مانند بدون تیغه¬های میانی ایجاد می-گردد و هایف کاذب یا سودوهایف نامیده می¬شود؛ در محیط CMA ظاهر میکروسکوپی این اشکال بسته به گونه مخمر بسیاراختصاصی می¬باشد. البته شناسایی قطعی گونه¬های مخمرها نیازمند تست¬های بیوشیمیایی و مورفولوژیک مفصل¬تری است (دیبا، 1390) (شکل 1-7 و 1-8).

<br />

شکل1- 7 سودوهایف مخمر (www.studyblue.com)

شکل 1- 8 کلنی های رشد یافته در محیط CHA و CMA
(D) T. beigelii. (E) C. krusei. .(A) C. albicans. (B) C. dubliniensis. (C) C. tropicalis
(F) C. glabrata. (G) C. parapsilosis. (H) C. neoformans. (I) C. guilliermondii.
(et al., 1999 Koehler) (J) S. cerevisiae. (K) P. wickerhamii.

1-5-2 بررسی رشد کلنی مخمرها در محیط کشت جامد و مایع
مطالعات متعددی درباره¬ی کلنی باکتری¬ها و قارچ¬های رشته¬ای صورت گرفته اما توجهات بسیار ناچیزی به کلنی¬های مخمر¬ها شده است. Pirt در سال1967 فاکتورهای فیزیکی و شیمیایی موثر در سرعت رشد کلنی¬ها را در محیط کشت جامد مشخص کرده است (Cooper et al, 1968؛ Wimpenny , 1979؛ Wimpenny&Parr, 1979).
مطابق با تحقیقات Pirt، زمانیکه مواد مغذی انتشار طولانی در مسیر رو به بالای کلنی داشته باشند، رشد به مناطق بیرونی (محیطی) کلنی محدود می¬شود. Reyrolle و Letellier در سال 1979 دو منطقه¬ی رشد، منطقه¬ی محیطی (مسئول افزایش قطر) و یک منطقه¬ی مرکزی (مسئول افزایش ارتفاع) را یافتند. در منطقه¬ی محیطی عامل اصلی برای رشد، تحرک بود. افزایش تقریباً خطی در ارتفاع کلنی¬ها که بعدها پایین می¬آیند، در طول دوره¬ی قبل از رشد گزارش شده است (Wimpenny , 1981).
Wimpenny و Lewis در سال 1977 میزان مصرف واقعی اکسیژن را برای پیش بینی عمق نفوذ اکسیژن به داخل کلنی¬ها بررسی کردند. میزان اکسیژن در کلنی¬ها و محیط کشت جامد با استفاده از میکرو الکترود¬ها اندازه¬گیری شد (Wimpenny&Coombs, 1983؛ Bungay et al, 1983).
Wimpenny در سال 1981گزارشی مبنی بر تنوع در اندازه و میزان رشد کلنی¬ها با توجه به در دسترس بودن اکسیژن و شرایط مختلف تغذیه¬ای ارائه داد. همچنین Fraleigh و Bungay در سال 1986میزان اکسیژن و شیب سوبسترا را در کلنی¬ها طراحی کردند (Cooper et al, 1968). کلنی سویه¬های هوازی مصرف کننده¬ی گلوکز (منبع کربن و انرژی) محیط کشت بوده، در حالی که اکسیژن (گیرنده¬ی نهایی الکترون) از فاز گازی منتشر می¬یابد.
Fraleighدر سال 1985 به دنبال غلبه بر مدل Gray and Kirwan شبیه سازی اکسیژن و شیب گلوکز در یکی از کلنی¬های میکروبی با استفاده از روش دوبعدی و همچنین با توجه به دو بستر (گلوکز و اکسیژن)، سنتیک¬های رشدی محدود می¬شود. او همچنین از بخش کروی شکل کلنی استفاده کرد.

1-5-3 محیط کشت جامد یا مایع اختصاصی مخمرها
مخمرها می¬توانند در محیط کشت مایع و یا سطح آگار جامد رشد کنند. سلول¬های مخمر در محیط کشت حداقل حاوی دکستروز (گلوکز) به عنوان منبع کربن و نمک، که تامین کننده¬ی نیتروژن، فسفر و مقدار کمی از فلزات است، رشد می¬کنند.
سلول¬های مخمر به سرعت در حضور محیط کشت غنی که شامل معرف¬هایی مانند عصاره مخمر و پپتون می¬باشند، رشد می¬کنند. این موضوع بسیاری از متابولیت¬ها را زمانیکه سلول تحت شرایط رشد حداقل است، سنتز می¬نماید (www.springer.com).
در فاز لگاریتمی رشد در محیط کشت غنی، سلول¬های مخمر تقریباً هر 90 دقیقه یکبار تقسیم می-شوند. اوایل فاز لگاریتمی، دوره¬ای است که تراکم سلول کمتر از 107 سلول بر میلی لیتر است. اواسط فاز لگاریتمی دوره¬ای است که در این زمان تراکم سلولی بین 1×107 و 5 ×107سلول بر میلی لیتر است و فاز لگاریتمی تاخیری (نهایی) زمانی اتفاق می¬افتد که تراکم سلولی بین 107×5 و 108×2 سلول بر میلی¬لیتر است (www.springer.com).
تیپ وحشی مخمر در دمای 30 درجه با هوادهی خوب و گلوکز بعنوان منبع کربن رشد می¬کند همچنین می¬تواند از انواع منابع کربن بجز گلوکز استفاده کند. بطور خاص از رافینوز و گالاکتوز تحت شرایطی برای از بین بردن سرکوب گلوکز (در مورد رافینوز) و یا برای القاء بیان پروموتر وابسته به Gal4p مانند GAL1 و GAL10استفاده می¬شود. همه¬ی آنها در غلظت (wt/vol) (20 g/L)2% استفاده شده و برای جایگزینی دکستروز محیط کشت مشخص یا غنی کاربرد دارد (www.springer.com).

مطلب مرتبط :   حفاظت، مصاحبه، مجلس، هیئت، دریاچه، شوندگان

1-5-4 تعیین تراکم سلولی (بهترین روش برای اندازه گیری تعداد سلول های مخمری)
تعداد تقریبی سلول¬ها در یک محیط کشت را می توان با دستگاه اسپکتروفتومتر با اندازه¬گیری چگالی نوری (OD) درطول موج 600 نانومتر بدست آورد. محیط کشت باید رقیق شود بطوریکه مقدار مشاهده شده¬ی (OD600) کمتر از 1 شود. در این محدوده یعنی OD600 = 1.0تقریباً برابر با 3×107 سلول بر میلی لیتر است. با این حال، دراین اندازه¬گیری تنوع سویه¬ای وجود دارد و یا ممکن است بیان محصول ژن خاص در یک سویه تحت تاثیر قرار بگیرد.
بهترین کار برای تعیین نمودار OD600 به عنوان تابعی از سلول¬های واقعی، شمارش با هموسیتومتر است. بسیاری از روشهای استفاده از ترانسفورماسیون و رشد مخمر در محیط کشت به تراکم سلولی خاص قبل از برداشت (محصول دادن) بستگی دارد (www.springer.com).

1-5-5 حفظ و تقویت سویه
سویه¬های مخمر را می¬توان در دمای 70- درجه در گلیسرول 15% ذخیره سازی نمود و برای مدت طولانی (بیش از 3 سال) نگه داشت. به صورت متناوب، می توان آنها را در دمای 4 درجه بر سطح محیط کشت غنی به مدت 6 ماه تا 1 سال نگه داشت (www.springer.com).
1-5-6 اسپور زایی بر روی پلیت یا محیط کشت مایع
احتیاج سلول¬های دیپلوئید به منبع نیتروژن و کربن سبب انجام میوز و تشکیل اسپور خواهد شد. اسپورزایی را می¬توان در سلول¬های رشد یافته در محیط کشت جامد و یا مایع مشاهده نمود. با این حال ممکن است سویه¬های خاصی در محیط کشت جامد یا مایع سبب تشکیل اسپورهای بهتری شوند.
سلول¬هایی که در محیط انتخابی رشد کرده اند، به مدت 3 تا 5 روز در دمای 25 درجه انکوبه شده چراکه اسپورزایی معمولاً در دماهای بالاتر کارایی چندانی ندارد. بطور کلی تشکیل اسپور بدلیل وجود تتراد (خوشه¬های چهار¬تایی داخل آسک) با میکروسکوپ (400-250×) دیده شد. نسبت اسپورزایی از گونه¬ای به گونه¬ی دیگر متفاوت است.
همانگونه که گفته شد برخی گونه¬ها در محیط کشت مایع، بهتر اسپورزایی می¬کنند. اغلب اسپورزایی در محیط کشت مایع در مدت زمان 48 ساعت به اتمام می¬رسد. به طور خلاصه سلول¬ها در محیط کشت انتخابی تا اواخر فاز لگاریتمی یا اوایل فاز ثابت، رشد می¬کنند (www.springer.com).

1-5-7 فرمولاسیون محیط های کشت در سیتم های دی هیبریدی
بطور کلی میکروارگانیسم¬ها در محیط¬های کشت غنی نسبت به محیط¬های معدنی رشد بهتری دارند. چراکه محیط¬های غنی حاوی پیش سازهای بیوسنتتیک بوده که می¬تواند بطور مستقیم به مسیرهای آنابولیک هدایت شود و سبب کاهش نیاز به تولید پیش سازهای بیوسنتزی و صرفه جویی در انرژی متابولیک می¬شوند. این امر دارای تاثیر معنی¬داری بر روی رشد است (Hahn-Hägerdal et al, 2005). سیستم دی هیبریدی یک ابزار موفق برای بررسی تعامل پروتئین پروتئین در سلول زنده است (Fields&Songs, 1989).
S. cerevisiae اساساً همانند باکتری¬ها پردازش شده است. کشت ساده، مقرون به صرفه، سریع و بی خطر می¬باشد. این مخمر در محیط کشت غیر انتخابی و در محیط کشت غنی (عصاره مخمر، پپتون و دکستروز) و محیط کشت انتخابی (بعنوان مثال با مارکرهای انتخابی) در محیط کشت حداقل SD حاوی مکمل¬های تغذیه¬ای مناسب رشد می¬کند. مکمل¬ها سبب افزایش رشد مخمر¬ها با استفاده از اسیدآمینه¬ها و پیش سازهای نوکلئوتیدی می¬شوند (Sherman , 1991 ؛ 1993 Lundbad, Treco&). اجزاء محیط کشت حداقل بجز مکمل های غذایی بخوبی تعریف شده است (Bia&Elledge, 1997).

1-5-7-1 محیط کشت YPD
محیط کشت YPD بنام YEPD نیز شناخته می¬شود که این محیط کشت از عصاره ی مخمر ، پپتون و دکستروز تشکیل شده و معمولاً برای رشد مخمر S. cerevisiae در شرایط غیر انتخابی (به عنوان مثال زمانیکه نگهداری پلاسمید انتخابی مورد نیاز نمی¬باشد)، استفاده می¬شود و می¬تواند برای پژوهش کاربردی که نیازمند محیط کشت مایع مخمری است همانند بیان پروتئین و کلونینگ و … مخمرها مورد استفاده قرار گیرد. این محیط اسیدآمینه¬ها، پیش سازهای نوکلئوتیدی، ویتامین¬ها و متابولیت¬های ضروری مورد نیاز برای رشد بهینه¬ی سلول را فراهم می¬کند (www.springer.com) (شکل 1-9).

مطلب مرتبط :   اخلاقی، حقوقی، اخلاق، حقوق، ضمانت، ضمان

شکل 1- 9 محیط کشت جامد و مایع YPD( en.wikipedia.org )
در محیط کشت جامد YPD در دمای 30 درجه تک کلنی¬ها ممکن است پس از 24 ساعت دیده شوند اما بطور کلی حداقل 48 ساعت برای رشد زمان لازم است (www.springer.com).
ترکیب محیط کشت غنی بخوبی تعریف شده است، در عین حال برخی گونه¬های جهش یافته در محیطYPD به طور متفاوتی رشد می¬کنند (Bia&Elledge, 1997؛ James et all, 1996 ) (جدول 1-1).
جدول 1-1 محتویات محیط کشت YPD
غلظت نهایی گرم بر لیتر
عصاره ی مخمر 1% 10
پپتون2% 20
دکستروز( گلوکز)2% 20
آگار( برای محیط جامد) 20

عصاره مخمر موجود در آن برای تامین ویتامین¬ها و سایر مواد مغذی بکار می¬رود. پپتون برای شکستن پروتئین¬ها کاربرد دارد. گلوکز یا دکستروز منبع تامین انرژی برای مخمر است (www.clontech.com).
سلول¬های مخمر هر 90 دقیقه یکبار در محیط کشت YPD در طول فاز نمایی چرخه ی رشد، تقسیم می¬شوند (Sherman , 1991؛ ,1993 Lundbad&Treco). YPD می¬تواند بعنوان یک محیط جامد یا مایع با افزودن آگار به غلظت نهایی 2% ، تهیه گردد ( Bia&Elledge, 1997؛ James et all, 1996).

1-5-7-2 محیط کشت YPAD
با افزایش آدنین به محیط YPD محیط YPAD ایجاد می شود. این محیط سبب افزایش رشد برخی از سویه¬های دی هیبریدی مخمر می¬شود. سویه¬های مخمری با جهش در ژن ADE2 سبب تجمع رنگدانه¬های قرمز و قابل دید، مانند کلنی¬های قرمز می¬شوند (Fisher , 1969 ). تجمع رنگدانه¬ها رشد را کند می¬کند (et al, 1998 Dela Cruz). افزودن آدنین نشان می¬دهد که تجمع رنگدانه¬های قرمز اشاره به کاهش سرعت رشد دارد (Sherman , 1991).
در برخی از سلول¬ها، به خصوص آن دسته ازگونه¬های حاوی یک جهش ade، آدنین ممکن است به YPDاضافه گردد (YPAD). فرمول سنتز کامل محیط کشت، در مقدار آدنین متفاوت می¬باشد طوری که در برخی از آنها مقدار آدنین به حدی زیاد است که کلنی¬ها هرگز به رنگ صورتی یا قرمز دیده نمی¬شوند (Fisher , 1969 ) (جدول 1-2 و شکل 1-10).
جدول 1-2 محتویات محیط کشت YPAD

غلظت نهایی گرم بر لیتر
عصاره ی مخمر 1% 10
پپتون2% 20
دکستروز( گلوکز)2% 20
آدنین همی سولفات0.004% 40 میلی گرم
آگار( برای محیط جامد) 20

شکل 1- 10 محیط کشت YPAD (www.ookaboo.com)

1-5-7-3 محیط کشت DM
محیط کشت معدنی تعریف شده¬ی DM برای رشد مخمر در شرایط هوازی و محدود از نظر اکسیژن استفاده شد (Verduyn et al, 1992). این محیط تقریباً شامل تمام اجزاء محیط کشت YNB بوده اما برخی از ترکیبات در غلظت بالاتری وجود دارند. محیط کشت DM بطور معمول برای بدست آوردن داده¬های فیزیولوژیکی کمی مخمر، همچنین برای بررسی محدودیت در میزان غلظت ویتامین¬ها و عناصر کمیاب رشد، طراحی شده است (Verduyn et al, 1992). کلرید سدیم ، ریبوفلاوین و فولیک اسید موجود در این محیط برای رشد مخمر ساکارومایسس ضروری نیستند. در حالیکه کبالت رشد این مخمر را پشتیبانی می¬کند. EDTA ی موجود در آن به نظر می¬رسد که برای حل کردن خوب غلظت عناصر کمیاب استفاده می¬شود (Verduyn et al, 1992) (شکل 1-11).

شکل 1- 11 محیط کشت DM (www.stemcell.com)

1-5-7-4 محیط کشت YPG
محتویات محیط کشت YPG و مقدار مورد نیاز برای تهیه ی یک لیتر از آن شامل: عصاره¬ی مخمر 1% (10 گرم)، پپتون 2%(2 گرم) و گلیسرول 3%v/v (30 میلی لیتر) می¬باشد محیط کشت YPG دارای گلیسرول به عنوان منبع غیر کربنی می¬باشد. Aoki و همکارانش برای اولین بار از محیط کشت حاوی گلیسرول برای تولید زیست توده¬ی مخمری استفاده کردند (Aoki et al, 2002) (شکل 1-12).

شکل 1- 12 محیط کشت YPG (www.biomedsearch.com)

1-5-7-5 محیط کشت YPAC
در مواردی که لازم است سلول مخمر دیپلوئید هاگ¬آور شود، در محیط کشت دارای کمبود نیتروژن، از استات به عنوان منبع کربن برای پیشرفت تنفس استفاده شده است. یک فرمول کلی برای این محیط کشت، 1% استات پتاسیم، 1% عصاره ی مخمر و 0.05% دکستروز می¬باشد و اسپورزایی سلول دیپلوئید می-تواند در محیط مایع یا بر روی پلیت انجام شود (www.springer.com).

1-6 بخش ششم: مسیرهای متابولیسم مخمر
متابولیسم مواد مغذی به جذب بیوشیمیایی (در مسیرهای آنابولیک) و کاتابولیسم (در