شدند تا وزن خشک (DW) آنها اندازهگیری شود. در نهایت میزان نسبی آب برگ از طریق رابطه زیر محاسبه شد (2-5)، [Yamasaki and Dillenburg, 1999].
(2-5)
2-6-5- نشت یونی نسبی
به منظور اندازه گیری نشت یونی نسبی، 5/0گرم از برگهای قسمت بالایی (برگهای توسعه یافته از گرههای 4 و 5) و برگهای قسمت پایینی شاخه (پایین ترین برگها در شاخه اصلی)، در پایان آزمایش، از هر ژنوتیپ جداگانه وزن و در داخل ویالهای شیشه ای ریخته شدند و 25 میلی لیتر آب مقطر به آنها اضافه شد. نمونهها به مدت 24 ساعت درون شیکر با دمای 24 درجه سانتیگراد و با سرعت 120دور در دقیقه قرار داده شدند و پس از 24 ساعت میزان هدایت الکتریکی اولیه (Lt)، آنها به وسیله دستگاه EC متر دیجیتالی (مدل Metrohm 644) اندازهگیری شد. سپس نمونهها به مدت یک ساعت در حمام بن ماری در دمای 120 درجه سانتیگراد قرار داده شدند و مجددا به مدت دو ساعت شیکر شدند و میزان هدایت الکتریکی نهایی (LO) آنها اندازهگیری شد و در نهایت درصد نشت یونی طبق فرمول زیر محاسبه شد (2-6)، [Lutts et al., 1995].
(2-6) 100×(LT/LO)
2-6-6- درصد آسیب دیدگی غشاء سلولی
بعد از محاسبه درصد نشت یونی نسبی برای هر نمونه، درصد آسیب دیدگی غشاء سلولی در نمونههای تحت تیمار شوری نسبت به نمونههای شاهد از طریق رابطه زیر محاسبه شد (2-7):
=درصد آسیب دیدگی1- [1- (T1/T2)/ 1- (C1/C2)] × 100 (2-7)
که در آن، (T1 و T2) به ترتیب هدایت الکتریکی اولیه و نهایی در نمونههای تحت تیمار شوری و (C1 و C2)، به ترتیب هدایت الکتریکی اولیه و نهایی در نمونههای شاهد است [Lutts et al., 1995].
2-6-7- فنل کل
2-6-7-1- استخراج از بافت برگ
برای استخراج عصاره برگ جهت اندازه‌گیری فنل کل و ظرفیت آنتیاکسیدانی از روش بخشی و آراکاوا [Bakhshi and Arakawa, 2006] استفاده شد. مقدار 1 گرم از نمونههای برگ از برگهای شاخه اصلی (برگهای توسعه یافته از گرههای 4 و 5) در پایان آزمایش، با استفاده از نیتروژن مایع در هاون چینی به پودر نرم تبدیل شد. به پودر حاصل، 4 میلیلیتر حلال استخراج، متشکل از 85% متانول و 15% استیک اسید، اضافه شد. پس از مخلوط کردن، نمونهها برای انجام عمل استخراج به مدت 24 ساعت در یخچال با دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
سپس بخش روشناور نمونه ها داخل میکروتیوب ریخته شدند و با دور 10000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ (مدلEpendorf 5417 R )، شدند. بعد از سانتریفیوژ، بخش روشناور نمونهها جداسازی و در داخل میکروتیوب ریخته شدند و جهت انجام آزمایشهای مورد نظر در یخچال با دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شدند [Bakhshi and Arakawa, 2006] .
2-6-7-2- تعیین میزان فنل کل با روش اسپکتروفتومتری
میزان فنلکل در عصارههای برگ با روش Folin-Ciocalteu و با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازهگیری شد. بدین منظور، ابتدا 1/0 گرم اسیدگالیک با متانول به حجم 100 میلیلیتر رسانده شد، سپس محلول 10 درصد فولین (5 میلیلیتر فولین با آبمقطر به حجم 50 رسانده شد) و کربنات سدیم 5/7 درصد (5/7 گرم کربنات سدیم در 100 سیسی آب حل شد) تهیه شد. محلول به دست آمده به مدت 5/1 ساعت در تاریکی و در دمای اتاق نگهداری شد و بعد از آن میزان جذب با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 760 نانومتر اندازهگیری گردید [Singleton et al., 1999].
برای تهیه محلولهای استاندارد، مقدار 1/0 گرم گالیک اسید با متانول خالص به حجم 100 میلیلیتر رسانده شد. سپس از این محلول استاندارد به ترتیب مقادیر حجمی 5، 10، 20، 30، 40، 50، 60، 70، 80، 90، 100 و 120 میکرولیتر برداشته و داخل لوله آزمایش شیشهای ریخته شد. به هر کدام از آنها مقدار 2500 میکرولیتر فولین رقیق شده با آب مقطر افزوده شد. پس از 10 تا 15 دقیقه، 2000 میکرولیتر کربنات سدیم اضافه گردید. میزان جذب محلولهای استاندارد پس از 5/1ساعت قرائت گردید. سپس منحنی استاندارد از روی الگوی جذب ترسیم شد. میزان فنل کل از روی میزان جذب نمونه و مقایسه آن با منحنی استاندارد (شکل 2-1)، بر حسب میلیگرم گالیک اسید در یک گرم ماده تر گیاهی بیان شد.

مطلب مرتبط :   تلویزیون، رادیو، صداوسیما، خدمت، نهاد، خرده

شکل 2-1- منحنی و معادله استاندارد فنل کل بر حسب گالیک اسید
2-6-8- ظرفیت آنتیاکسیدانی کل
ظرفیت آنتیاکسیدانی عصارهها، از طریق خنثیکنندگی رادیکال آزاد DPPH (2و2 دیفنیل1-پیکریل هیدرازیل) تعیین شد. برای این منظور با استفاده از سمپلر، مقدار 50 میکرولیتر از عصارهها داخل لولههای فالکون کوچک ریخته شد و 950 میکرولیتر محلول DPPH 1/0 میلی نرمال به آنها اضافه شد. محلول حاصل به سرعت به هم زده شده و سپس به مدت 30 دقیقه در یک محفظه تاریک در دمای اتاق نگهداری شد. نمونه بلنک (صفر) و استاندارد به ترتیب شامل 1 میلیلیتر حلال استخراج و 1 میلیلیتر محلول 1/0 نرمال DPPH بود. سپس میزان جذب استاندارد و نمونه با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، در طول موج 517 نانومتر تعیین شد. ظرفیت آنتیاکسیدانی عصارهها به صورت درصد بازدارندگی DPPH با استفاده از رابطه زیر محاسبه شد (2-8)، [Singleton et al., 1999].
Antioxidant activity (DPPHSce%) = (Acont – Asamp)/Acont × 100 (2-8)
که در آن:
=%DPPHsc درصد بازدارندگی رادیکال
DPPH Acont = میزان جذب DPPH
Asamp= میزان جذب (نمونه + DPPH)
2-7-ارزیابی صفات بیوشیمیایی
2-7-1-کربوهیدراتهای محلول
نمونههای گیاهی تهیه شده، به مدت 48 ساعت درون آون در دمای 75 درجه سانتیگراد خشک و بعد آسیاب شدند و سپس با غربال مش شماره 8، الک شدند. 03/0 گرم از پودرهای تهیه شده درون تیوبهای 15 میلیلیتری ریخته شدند. سپس10 میلیلیتر اتانول80% کاملاً داغ به تیوبها اضافه و به مدت 30 ثانیه ورتکس شدند و به مدت 10 دقیقه با سرعت 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. بخش روشناور نمونهها به تیوبهای 50 میلیلیتری منتقل شدند و مراحل اضافه نمودن 10 میلیلیتر اتانول 80% داغ به رسوب انتهایی، ورتکس، سانتریفیوژ و اضافه نمودن روشناور به تیوب 50 میلیلیتر جدید دیگر، دوبار تکرار شد تا تمامی قندهای محلول موجود در نمونه گیاهی استخراج گردند. در مرحله بعد، تیوبها به مدت 24 ساعت درون آون با دمای 60 درجه سانتیگراد قرار داده شدند تا اتانول موجود در آنها کاملا تبخیر گردد. پس از تبخیر کامل اتانول، مقدار 40 میلیلیتر آب مقطر به تیوبها اضافه و به مدت 2 دقیقه ورتکس شدند. به منظور حذف رسوبات اضافی و دیگر ترکیبات زائد، مقدار 5 میلیلیتر سولفات روی 5% و 7/4 میلیلیتر هیدروکسید باریوم 3/0 نرمال به تیوبها اضافه و مجددا ورتکس شدند. سپس تیوبها با سرعت 3000 دور در دقیقه در دمای اتاق به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند. همزمان 1 میلیلیتر از روشناورها و 1 میلیلیتر از محلولهای استاندارد گلوکز (0، 10، 20، 40، 60، 80، 100 و 200 قسمت در میلیون) به تیوب 15 میلیلیتر جدید انتقال داده شدند و به هریک از آنها 5/0 میلیلیتر محلول فنل 5% اضافه و به شدت تکان داده شدند تا حبابهای کف سفید رنگ، داخل تیوبها نمایان شوند. مقدار 5/2 میلیلیتر اسید سولفوریک 98% بوسیله سرنگ (دیسپنسر42) به داخل تیوبها با فشار اضافه شد. پس از گذشت 45 دقیقه تا یک ساعت با تثبیت رنگ، توأم با خنک شدن تیوبها، میزان جذب نمونهها در طول موج 485 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازهگیری شد. در نهایت محتوای قندهای محلول، از روی میزان جذب نمونهها و مقایسه آن با منحنی استاندارد (شکل 2-2)، و با توجه به رابطه زیر (2-9)، بر حسب میلیگرم در گرم وزن خشک بیان شد [Kochert, 1987]
E=(C*D*V)/(DM*1000000)*1000 (2-9)
که در آن:
E : مقدار قند نمونه بر حسب میلیگرم در گرم وزن خشک
C : غلظت نمونه بر حسب میلیگرم در لیتر
D : درجه رقت
V : حجم نهایی عصاره تهیه شده
DM : وزن ماده خشک بر حسب گرم

شکل 2-2- منحنی و معادله استاندارد گلوکز

2-7-2-کربوهیدراتهای نامحلول
نمونههای گیاهی تهیه شده، به مدت 48 ساعت درون آون در دمای 75 درجه سانتیگراد خشک و بعد آسیاب شدند و سپس با غربال مش شماره 8، الک شدند. 03/0 گرم از پودرهای تهیه شده درون تیوبهای 15 میلیلیتری ریخته شدند. سپس10 میلیلیتر اتانول80% کاملاً داغ به تیوبها اضافه و به مدت 30 ثانیه ورتکس شدند و به مدت 10 دقیقه با سرعت 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. بخش روشناور نمونهها به تیوبهای 50 میلیلیتری منتقل شدند و مراحل اضافه نمودن 10 میلیلیتر اتانول 80% داغ به رسوب انتهایی، ورتکس، سانتریفیوژ و اضافه نمودن روشناور به تیوب 50 میلیلیتر جدید دیگر، دوبار تکرار شد تا تمامی قندهای محلول موجود در نمونه گیاهی استخراج گردند. تفالههای حاصل بعد از عمل شست و شو با اتانول جمع آوری و به مدت 2 ساعت درون دستگاه آون در دمای 50 درجه سانتیگراد خشک شدند. 5/4 میلیلیتر آب مقطر و 6 میلیلیتر پرکلریک اسید 52% به نمونهها اضافه شدند و به مدت 24 ساعت درون یخچال در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. سپس، بمنظور جداسازی فاز رویی محلول، نمونهها در 3000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند. روشناورهای به دست آمده، درون فالکون 50 میلیلیتری جدید ریخته شدند و 30 میلیلیتر آب مقطر به آنها اضافه شد.
همزمان 1 میلیلیتر از روشناورها و 1 میلیلیتر از محلولهای استاندارد گلوکز (0، 10، 20، 40، 60، 80، 100 و 200 قسمت در میلیون) به تیوب 15 میلیلیتر جدید انتقال داده شدند و به هریک از آنها 5/0 میلیلیتر محلول فنل 5% اضافه شد و به شدت تکان داده شدند تا حبابهای کف سفید داخل تیوبها نمایان شوند. مقدار 5/2 میلیلیتر اسید سولفوریک 98% بوسیله سرنگ (دیسپنسر) به داخل تیوبها با فشار اضافه شد. پس از گذشت 45 دقیقه تا یک ساعت با تثبیت رنگ، توأم با خنک شدن تیوبها، میزان جذب نمونهها در طول موج 485 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازهگیری شد. در نهایت محتوای قندهای نامحلول، از روی میزان جذب نمونهها و مقایسه آن با منحنی استاندارد (شکل 2-2)، و با توجه به رابطه زیر (2-10)، بر حسب بر حسب میلیگرم در گرم وزن خشک بیان شد [Kochert, 1987]
E=(C*D*V)/(DM*1000000)*1000 (2-10)
که در آن:
E : مقدار قند نمونه بر حسب میلیگرم در گرم وزن خشک
C : غلظت نمونه بر حسب میلیگرم در لیتر
D : درجه رقت
V : حجم نهایی عصاره تهیه شده
DM : وزن ماده خشک بر حسب گرم
2-7-3-پرولین
5/0 گرم ماده تر گیاهی از برگهای شاخه اصلی (برگهای توسعه یافته از گرههای 4 و 5) در پایان آزمایش با هاون له و درون تیوبهای 15 میلیلیتری ریخته شدند. سپس 10 میلیلیتر اسید سولفوسالیسیلیک 3 درصد به آنها اضافه شد و به مدت 10 دقیقه درون حمام آب یخ قرار داده شدند. تیوب‌ها با سرعت 15000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شدند تا مواد اضافی از محلول جدا شوند. 2 میلیلیتر از روشناور حاصل از سانتریفیوژ، درون تیوبهای 15 میلیلیتری جدید ریخته شدند و 2 میلیلیتر اسید نینهیدرین و 2 میلیلیتر اسید استیک خالص به آن افزوده و سپس خوب مخلوط شدند. همزمان مقدار 2 میلیلیتر از استانداردهای 0، 4، 8، 12، 16 و 20 میلیگرم در لیتر پرولین درون تیوبهای جدید ریخته و 2 میلیلیتر اسید نینهیدرین و 2 میلیلیتر اسید استیک گلاسیال به آن افزوده و سپس خوب مخلوط شدند. نمونههای اصلی و استاندارد ابتدا به مدت یک ساعت درون حمام آب گرم در دمای 100 درجه سانتی گراد و سپس به مدت 10 دقیقه درون حمام آب یخ قرار داده شدند تا کاملاً سرد شده و واکنش متوقف شود. سپس 4 میلیلیتر تولوئن به محلول اضافه شد و به مدت 20 ثانیه با دستگاه ورتکس هم زده شدند. میزان جذب نمونهها در طول موج 528 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازهگیری شدند. در نهایت محتوای پرولین، از روی میزان جذب نمونهها و مقایسه آن با منحنی استاندارد و با توجه به رابطه (2-11)، بر حسب میکرومول در گرم نمونه تر گیاهی بیان شد [Bates et al., 1973].
Proline (umol/gFw)=([(µg Proline/ml×ml Toluene)/(115.5µg/(µmole))])/((g sample/5)) (2-11)
شکل 2-3- منحنی و معادله استاندارد پرولین

مطلب مرتبط :  

2-7-4- پراکسیداسیون لیپیدها
برای سنجش مقدار پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء، غلظت مالوندیآلدئید و سایر آلدئیدها که محصولات اکسیداسیون اسیدهای چرب غیراشباع هستند، اندازهگیری شد.
2-7-4-1- مالون دیآلدئید (MDA)
2/0 گرم از بافت تازه برگی از برگهای شاخه اصلی (برگهای توسعه یافته از گرههای 4 و 5) در پایان آزمایش در هاون چینی حاوی 5 میلیلیتر تریکلرواستیک اسید 1/0 درصد سائیده شد.