دانلود پایان نامه

استخراج DNA
استخراج DNA یکی از اولین و مهمترین مراحل در آزمایش های بیولوژی مولکولی است. DNA ژنومیک پستانداران مولکولی بسیار طویل است، بنابراین مراحل انجام کار باید به گونه ای باشد تا حداقل تکان و سانتریفوژ در آن لحاظ گردد تا از تخریب آن جلوگیری به عمل آید.
معمولاً برای استخراج DNA از روش های متعددی مانند افنیتی، استخراج و رسوب نمکی، فنل – کلروفرم و رسوب ایزوپروپانول استفاده می گردد.
در این مطالعه ما از دو روش استخراج DNA استفاده کردیم، روش استخراج DNA به روش فنل- کلروفرم و همچنین از روش Solting out بوسیله DNPTM کیت تولید شده توسط شرکت سیناژن استفاده گردید.
استخراج DNA به روش فنل کلروفرم
این روش شامل چهار مرحله به شرح زیر میباشد:
آزادسازی DNA سلول (مرحله لیز سلولی)
در این مرحله از بافر لیزکننده استفاده میشود. تریس موجود در بافر لیزکننده نقش بافری EDTA به عنوان مهار کننده آنزیم DNase و SDS به عنوان حل کننده چربیهای موجود در غشای سلول و نمونه عمل میکند.
مواد موجود در بافر لیز نقش تغییر در فشار اسمزی اطراف سلول را دارد که باعث پاره شدن غشای سلول میشود.
مرحله حذف مواد آلی
پروتئینها توسط فنل از نمونه حذف میشوند. فنل با PH بیشتر از 7 باعث دناتوره شدن پروتئینها میشود و کلروفرم نیز بقایای فنل را از محلول واکنش حذف میکند. وجود مقادیر کم فنل در نمونه یک مهار کنندهی مهم در واکنش PCR است. پروتئینهای دناتوره شده به صورت یک لایه سفید در حد واسط فاز آبی و فنل دیده میشوند.
استات سدیم DNA را یونیزه میکند و از حل شدن آن در محیز غیر آبی میکاهد. الکل با درجه خلوص بالا درصد آب موجود در نمونه را کاهش میدهد و DNA به شکل کدورت غیر محلول ظاهر میشود.
این مرحله با اتانول 70 درجه انجام شد و پس از خشک شدن، DNA در آب مقطر حل شد.
نکته: در طی پروسه استخراج و تخلیص اسیدهای نوکلئیک باید دقت شود تا نوکلئازها به DNA و RNA آسیب نرسانند.
روش انجام استخراج DNA به روش فنل- کلروفرم
1- به نمونههای بافیکوت بدست آمده ناشی از پروسه خالص سازی، مقدار 500 میکرولیتر بافر لیز اضافه و 60 دقیقه به آن زمان داده میشود.
2- به مدت 5 دقیقه با دور بالا (12000 دور در دقیقه) سانتریفوژ انجام شد و سپس مایع رویی دور ریخته شد.
3- عمل ذوب و انجماد 2 مرتبه در آب ᵒ90 و فریزر (ᵒ24-) هر کدام به مدت 5 دقیقه انجام شد. (برای جلوگیری از پاره شدن درب میکروتیوپ از Cap استفاده شد)
4- مقدار 5 میکرولیتر پروتئیناز K اضافه، کمی تکان داده و به مدت 1 ساعت در بنماری 55 درجه انکوبه شد.
5- 500 میکرولیتر فنل به میکروتیوپ اضافه، به آرامی سروته کرده و به مدت 2 دقیقه با دور بالا سانتریفوژ شد.
6- مایع رویی به میکروتیوپ دیگر منتقل شد.
7- هم حجم آن کلروفرم اضافه، به آرامی سروته کرده و به مدت 2 دقیقه با دور بالا سانتریفوژ شد.