دانلود پایان نامه
هر آنزیم DNA پلیمراز قادر به گسترش پرایمر متصل به مولکول DNA تک رشته است اما همه آنزیم های پلیمراز را نمی توان برای توالی یابی DNA به کار برد. علت این است که بسیاری از DNA پلیمرازها دارای مخلوطی از چند فعالیت آنزیمی هستند که امکان تجزیه DNA را در کنار سنتز آن فراهم می سازد تجزیه در هر دو جهت 5َ به 3َ و 3َ به 5َ می تواند صورت پذیرد و هر دو فعالیت برای توانایی صحیح به روش خاتمه زنجیره مشکل زا هستند. فعالیت اگزونوکلئازی 5َ به 3َ سبب می شود که آنزیم پلیمراز نوکلئوتیدها را از انتهای 5َ رشته های تازه سنتز شده حذف کند که طول این رشته ها را تغییر می دهد و امکان توالی را از روی الگو نوارها ایجاد نشده روی ژل پلی اکریلامید غیر ممکن می سازد. فعالیت 3َ به 5َ می تواند اگر مشابهی داشته باشد اما عمدتاً ddNTP را که در انتهای 3َ رشته اضافه شده است را حذف می کند و مانع خاتمه زنجیره می شود.
در روش اصلی توال یابی با روش خاتمه زنجیره، از آنزیم پلی مراز کلنو به عنوان آنزیم توالی یابی استفاده شده است. این آنزیم نوع تغییر یافته ای از آنزیم DNA پلیمراز I باکتری E.Coli است. این تغییر شامل حذف فعالیت اگزونوکلئازی 5َ به 3َ آنزیم استاندارد است، با وجود این، آنزیم پلیمراز کلنو دارای پیمایش پایینی است یعنی قبل از آن که به واسطه عوامل طبیعی از رشته الگو جدا شود، تنها بخش نسبتاً کوتاهی از رشته الگو جدا شود، تنها بخش نسبتاً کوتاهی از رشته DNA را سنتز می نماید. این ویژگی طول توالی بدست آمده از یک واکنش را به حدود 250 جفت باز محدود می کند. برای اجتناب از این مشکلات، اغلب دستگاه های توالی یابی امروزی از آنزیم اختصاصی تری مثل آنزیم سکوناز که نوع تغییر یافته آنزیم DNA پلیمراز کد شده توسط باکتریوفاژ T7 است، استفاده می کنند. این آنزیم دارای پیمایش بالایی است و فعالیت اگزوتئکلئازی ندارد و لذا برای توالی یابی به روش خاتمه زنجیره مناسب بوده و امکان تعیین 750 باز در هر آزمایش را می دهد.
پرایمر می تواند ناحیه ای ناحیه ای از DNA الگو را که قرار است مورد توالی یابی قرار گیرد مشخص کند
در اولین مرحله از توالی یابی به روش خاتمه زنجیره، یک پرایمر الیگونوکلئوتیدی به رشته DNA الگو متصل می گردد. عملکرد اصلی پرایمر، فراهم کردن یک منطقه کوتاه دو رشته ای می باشد که برای شروع سنتز DNA توسط DNA پلیمراز ضروری است. دومین نقش حیاتی پرایمر، تعیین ناحیه ای از مولکول الگو است که قرار است تحت عملیات توالی یابی قرار گیرد.
نحوه مقایسه توالی محصول PCR در بانک ژنی
جهت یافتن توالی مورد نظر از بانک ژنی از نرمافزار Choromaspro version 1.41 استفاده شد به اینصورت که توالی را در نرم افزار Blast کپی کرده و با توالی موجود در بانک ژنی مقایسه کردیم. (به ترتیب از ‏شکل (3-3) الی ‏شکل (3-6) ). توالی مورد نظر در ژن، توالی GCCTGAT//GGCCACACCCAA//CGGAA و نوکلئوتید های مورد بحث، در نقاط مشخص شده T//G و A//C مورد بررسی قرار گرفته و ژنوتایپ نمونهها مشخص گردید.
توالی مورد نظر با استفاده از نرمافزار Choromaspro version 1.41 بررسی گردید.
از امکانات دیگر نرمافزار Choromaspro version 1.41 بررسی توالی با استفاده از کروماتوگرام است
پس از حصول اطمینان از وجود توالی مورد نظر، با استفاده از نرم افزار موجود در سایت PUBMED، توالی را BLAST کردیم.
توالی مورد نظر را با توالی موجود در بانک ژنی مقایسه کردیم.
نتایج و بحث
نتایج حاصل از جمعآوری نمونهها
از تعدا 15 کودک با تشخیص قطعی سرطان خون لنفوئیدی حاد (ALL) توسط روش فلوسایتومتری، 15 نمونه خون همراه ماده ضد انعقاد گرفته شد.
اطلاعات دموگرافیک بدست آمده از 15 بیمار تا انتهای مطالعه به شرح زیر میباشد.
از 15 بیمار 11 بیمار پسر و 4 بیمار دختر بودند. (نمودار ‏شکل (4-1) )
میانگین سنی این افراد 6/4 بود که با توجه به انحراف معیار 7/2 میتوان گفت که توزیع نرمال بودهاست. توزیع سنی کودکان در نمودار ‏شکل (4-2) گزارش گردیدهاست.
همه 15 بیمار با تشخیص ALL بودند.
از مجموع 15 بیمار مورد مطالعه 6 بیمار با درمان نگهدارنده T- Cell و 9 بیمار با درمان نگهدارنده B- Cell pre مورد درمان قرار گفتند.
نمودار توزیع پراکندگی جنسی افراد بیمار شرکت کننده در مطالعه
نمودار توزیع فراوانی سنی افراد بیمار شرکت کننده در مطالعه
نتایج حاصل از کنترل پروسه استخراج
نتایج استخراج DNA به روش فنلکلروفرم نشان داد که در برخی از نمونههای استخراج شده توسط این روش عمل آمپلیفای شدن DNA احتمالاً به علت وجود ممانعت کنندههای موجود، به سختی صورت گرفت و محصول PCR حاصل از همان نمونه توسط کیت تجاری استخراج شده بود، دارایی باند بهتری بود. این یعنی در نمونههای استخراج شده DNA توسط کیت، عمل PCR بهتر صورت گرفته که این امر کمتر بودن ممانعت کنندهها را در DNA بهدست آمده از روش کیت را نشان میدهد.