دانلود پایان نامه
1. نمونه روی ژل آگاروز ران شده و عکس ژل ارسال گردید.
2. عکس ژل واضح و به گونه ای بود که وجود باند اختصاصی، غیر اختصاصی و دایمر پرایمر نیز مشخص شده بود.
3. نام و مقدار (میکرولیتر)DNA لود شده بر روی ژل بایستی بر روی عکس نیز درج گردید.
4. نمونه ها (DNA و پرایمرها) در تیوب های 5/0 میلی لیتری ریخته شده و حاوی برچسب خوانا بود.
5. نمونهها در ظرف و شرایط مناسب (دمای کمتراز 15 درجه) ارسال گردید.
6.  نباید درب تیوپ های حاوی نمونه با پارافیلم بسته میشد.
7.  نمونه از نظر وجود باند غیر اختصاصی و دایمر پرایمر خالص سازی گشت؛ که در مرحله نهایی بجای ایلوشن بافر از آب مقطر (ترجیحاً آب مقطر تزریقی) گرم (40 درجه و بمقدار 30 مایکرولیتر) استفاده گردید.
8. مقدار مورد نیاز از هر نمونه به غلظت آن بستگی داشت ولی بطور متوسط از هر نمونه حداقل 10 مایکرولیتر ارسال گردید.
9.  غلظت پرایمرهای ارسالی 10 پیکومول بود و غلظت و نام پرایمر بر روی لیبل ذکر گردید. مقدار مورد نیاز از هر پرایمر 10 پیکومولی، حداقل 10 مایکرو لیتر بود.
10.  نمونه های ارسالی پس از انجام کار حداکثر بمدت یک ماه در آن مرکز نگهداری و سپس دور ریخته می شود.
توالی یابی ژن ها و ژنوم ها
توالی یابی ژن ها حدود 40 سال است که مطرح شده است و از اواسط دهه 1970 توالی یابی سریع و کارآمد امکان پذیر شده است در آغاز، این روش ها برای ژنهای منفرد کاربرد داشت اما از اوایل دهه 1990 تعداد رو به افزایشی از توالی های کل ژنومی به دست آمده است.
شناخت روش های توالی یابی
روش های متعددی برای توالی یابی DNA وجود دارد مرسوم ترین روش که در اواسط دهه 1970 و برای اولین بار بوسیله فرد سنگر و همکارانش اختراع شد، روش خاتمه زنجیره می باشد. این روش به دلایل متعدد به عنوان روش برگزیده می باشد که از اهم این دلایل سهولت نسبی این روش برای استفاده از آن در توالی یابی های خودکار است.
توالی DNA به روش خاتمه زنجیره
توالی یابی DNA به روش خاتمه زنجیره بر این اصل استوار است که مولکول های DNA تک رشته ای که تفاوت طول آن ها فقط در یک نوکلئوتید است قابل جداسازی با پلی اکریلامید ژل الکتروفوز هستند این بدان معناست که امکان تفکیک مجموعه ای از مولکول ها که در برگیرنده تمام اندازه های پلی نوکلئوتیدی از 10 تا 1500 نوکلئوتید است به صورت مجموعه ای از نوارها روی ژل صفحه ای یا موئینه وجود دارد.
نگاهی اجمالی به توالی یابی به روش خاتمه زنجیره
مواد آغازگر جهت توالی یابی DNA به روش فوق شامل تهیه مولکول های DNA تک رشته ای یکسان است. قدم اول، متصل کردن یک الیگونوکلئوتید کوتاه (پرایمر) به یک محل مشابه در هر مولکول تک رشته ای می باشد که مکمل رشته الگو است عمل می کند.
واکنش سنتز رشته جدید با آنزیم DNA پلیمراز و در حضور چهار دئوکسی ریبونوکلئوتید تری فسفات (d-GTP, dTTP, dATP, dCTP- dNTP) به عنوان سوبسترا می تواند تا پلیمریزه شدن هزاران نوکلئوتید ادامه یابد؛ اما در روش خاتمه زنجیره، این مسأله اتفاق نمی افتد؛ زیرا علاوه بر چهار دئوکسی نوکلئوتید تعداد محدودی از چهار نوع دی دئوکسی نوکلئوتید (ddGTP, ddTTP, ddATP,ddCTP- ddNTP) نیز به واکنش اضافه می شود که علاوه بر نبود OH در جایگاه 2َ، در جایگاه 3َ نیز فاقد OH است. هر کدام از این چهار دی دئوکسی نوکلئوتید دارای یک نشانگر فلورسنت متفاوت هستند.
آنزیم پلیمراز قادر به افتراق بین دئوکسی و دی دئوکسی نوکلئوتید نیست اما در صورتی که از دی دئوکسی نوکلئوتید استفاده شود، واکنش طویل سازی متوقف می شود زیرا گروه 3َ- هیدروکسیل که برای اضافه شدن نوکلئوتید بعدی مورد نیاز است وجود ندارد به علت وجود دئوکسی نوکلئوتید در مقادیر بیشتر از دی دئوکسی نوکلئوتید، واکنش غالباً در ابتدا و در نزدیک به پرایمر توقف نمی کند در حقیقت، قبل از اضافه شدن یک دی دئوکسی نوکلئوتید ممکن است صدها نوکلئوتید پلیمریزه شده باشد نتیجه اتفاقات فوق، مجموعه ای از مولکول های جدید با اندازه های مختلف است که هر مولکول به یک دی دئوکسی نوکلئوتید با نشانگری که معرف نوکلئوتید خاص (A, C, G یا T) می باشد ختم شده است. محل این نوکلئوتید منطبق با محل آن در رشته الگو می باشد.
برای مشخص کردن توالی DNA، تمام کاری که بایستی انجام گیرد مشخص کردن دی دئوکسی نوکلئوتید انتهای هر مولکول خاتمه یافته است. در اینجا از ژل پلی آکریلآمید استفاده می شود زیرا توان تمایزی بسیار بیشتری نسبت به آگارز دارد. بعد از جداسازی، مولکول ها از مقابل آشکارساز فلورسانتی عبور می کنند که می تواند نشانه های متصل به دی دئوکسی نوکلئوتیدها را مشخص کند بنابراین آشکار ساز تعیین می کند که هر مولکول با کدام یک از نوکلئوتیدهای A, C, G یا T خاتمه یافته است. توالی حاصل می تواند جهت بررسی چاپ شده و در اختیار متصدی قرار گیرد یا اینکه جهت تجزیه و تحلیل در آینده درون یک دستگاه حافظه اطلاعات ذخیره گردد.
همه آنزیم های DNA پلیمراز را نمی توان برای توالی سازی استفاده کرد