دانلود پایان نامه

Precipitation Solution(Isopropanol Base)
5 ml
Protease Buffer
2 50 ml
Wash Buffer (Ethanol Base)
2 × 1250 μl
Solvent Buffer
کیت استخراج DNA 50 تست
آماده سازی نمونه
همانطور که گفته شد ماده ضد انعقاد مورد استفاده EDTA (1mg/ml) برای جلوگیری از لخته شدن و کاهش DNA می باشد، نباید از خون حاوی ماده ضد انعقاد خون هپارین برای استخراج DNA استفاده شود، زیرا هپارین از فعالیت Taq پلی مراز (آنزیم مورد نیاز برای تکثیر قطعات DNA در روش PCR) جلوگیری می کند. وجود EDTA حداقل mM ۲ در بافر استخراج باعث می شود که کوانزیم های آنزیم DNAase با EDTA شلات شود و از تجزیه تصادفی DNA جلوگیری نماید. محصول به دست آمده از λ 100 از خون تازه حدود μg 0/5-1 می باشد.
پروتکل آزمایش
1-Pre- warm: کیت قبل از استفاده با هوای آزمایشگاه هم دما گردید، بنابراین یک ساعت قبل از انجام آزمایش کیت را از یخچال خازج می کنیم (باید توجه داشت که پروتئاز را نباید در دمای بالاتر از 20- درجه قرار داد، زیرا این آنزیم به ازای هر یک ساعت که در دمای محیط باشند 50% فعالیتشان را از دست می دهند).
– Pre- warm محلول Lysis Solution: قرار دادن آن در 37 درجه و تکان دادن ملایم به مدت 10 دقیقه سبب میشود محلول کاملاً هموژن گردد.
2- μl 100 بافی کوت را با μl 400 از محلول لیز کننده را در داخل میکروتیوب ریخته و به مدت 20- 15 ثانیه ورتکس می کنیم. در این مرحله نمونه کاملاً به صورت سوسپانسیون هموژن تبدیل میشود، در صورت وجود هر گونه لخته یا ماده نامحلول باید ورتکس را ادامه داد.
3- در این مرحله μl 300 محلول حل کننده را به مخلوط قبلی اضافه کرده و 5 ثانیه ورتکس کرده و سپس در سانتریفوژ g 12000 به مدت 10 دقیقه قرار دادیم.
4- مایع درون میکروتیوب را خالی می کنیم و میکروتیوب ها را بر روی دستمال کاغذی تمیز به صورت وارونه قرار می دهیم تا مایع درون آنها کاملا خارج شود. نمونه ها را با فاصله از هم قرار میدهیم تا هیچ نوع تماسی با هم نداشته باشند، زیرا باعث ایجاد آلودگی DNA و تولید دو یا چند محصول در مرحله PCR می شود.
5- در این مرحله ml1 از محلول شستشو را در میکروتیوب حاوی DNA ریختیم. سپس آن را 5-3 ثانیه ورتکس کرده و در g 12000 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ نمودیم. در صورت نیاز این مرحله تکرار شد.
6- بهمنظور خارج کردن محلول شستشو از میکروتیوب، وارونه کردن آن بر روی دستمال کاغذی سبب گرفتن محلول اضافی گردید و خشک کردن آن در دمای 65 درجه به مدت 5 دقیقه نیز در مواقعی که اطمینان حاصل نشدهبود، بهکار گرفته شد.
7- اضافه کردن μl50 بافرحلکننده، چند ثانیه spin می کنیم تا اگر حلال یا DNA ای به قسمت های بالایی دیواره میکروتیوب چسبیده باشند، در قسمت پایین جمع شوند. سپس آن را به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه قرار دادیم.
نگهداری DNA در 20- درجه یا 70- درجه از تخریب DNA سلولی توسط آنزیم DNase جلوگیری می کند.
تعیین خلوص DNA
استفاده از اسپکتروفتومتر و قرائت OD