دانلود پایان نامه

DNA مورد نظر به نسبت 1 به 20 با آب مقطر دیونیزه استریل رقیق شد و جذب نوری آن در طول موج nm 260 خوانده شد و سپس OD بدست آمده در عدد 50 و ضریب رقت 20 ضرب نموده و غلظت DNA بر حسب Mg/ml محاسبه گردید. البته OD بدست آمده را در مقایسه با جذب نوری در 280 نانومتر و همچنین 230 نانومتر مورد بررسی قرار دادیم. نسبت OD 230/260 نشانگر خلوص DNA نسبت به فنل است که این یعنی مراحل نهایی استخراج که حاصل جداسازی و تخلیص فنل و ترکیبات آروماتیک است، درست انجام پذیرفته است یا خیر. در غیر اینصورت در مراحل PCR اختلال ایجاد میگردد. نسبت OD 280/260 نیز به منطور بررسی خلوص DNA نسبت به پروتئین است که عدم تخلیص پروتئینها بخصوص در موارد استخراج DNA از خون به علت مداخله هموگلوبین حائز اهمیت است
برای تعیین میزان DNA به دست آمده و تعیین مقدار خلوص آن از اسپکتروفوتومترهای UV استفاده می گردد. یک واحد جذبی در طول موج 260 نانومتر معادل μg/ml 50 مولکول DNA در cm2 1 کوت کوارتز است. در طول موج 280 نانومتر، پروتئین ها هم جذب دارند. برای اینکه میزان دقیق DNA محاسبه شود، نسبت میزان جذب نوری در طول موج 260 به 280 نانومتر را محاسبه می کنند. اگر این مقدار بین 8/1 و 2 باشد خلوص DNA مناسب است ولی اگر بیش از 2 باشد نشان دهنده آلودگی به RNA و اگر این نسبت کمتر از 8/1 باشد نشان دهنده آلودگی به پروتئین است. میزان جذب در طول موج 325 نانومتر نشان دهنده وجود ذرات معلق در محلول با کثیف بودن کوت است. طول موج 230 نانومتر نشان دهنده وجود باندهای مواد آروماتیک فنل و اوره می باشد. OD قرائت شده بیانگر خلوص بالای DNA می باشد بنابراین نمونه ها را در دمای 20- قرار می دهیم.
الکتروفورز روی آگارز 1%
5 میکرولیتر از نمونه DNA استخراج شده از روی ژل آگارز 1% برده و کیفیت باند بررسی می شود. این روش به منظور بررسی صحت DNA و عدم وجود اسمیر کشیده استکه نشانگر تخریب DNA حین فرآوری میباشد.
حفظ و نگهداری DNA
به علت فاصله زمانی،DNA استخراج شده در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد تا مراحل بعدی روی آن ها صورت گیرد.
واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)
اولین و مهمترین روش در مطالعه ژن ها، واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) می باشد. PCR روش بسیار ساده ای است. کل فرآیند عبارتست از این که یک ناحیه کوچکی از مولکول DNA مثل یک ژن به وسیله آنزیم DNA پلیمراز بارها کپی می شود. این روش ممکن است روش نسبتاً پیش پا افتاده ای به نظر برسد ولی دارای کاربردهای متعددی در تحقیقات ژنتیک و حیطه های وسیعی از زیست شناسی است.
نگاهی کلی بر واکنش زنجیره ای پلیمراز
واکنش زنجیره ای پلیمراز منجر به تکثیر انتخابی ناحیه خاصی از مولکول DNA می شود هر ناحیه از هر مولکول DNA را می توان انتخاب نمود به شرط آن که توالی دو انتهای آن مشخص باشند، زیرا به منظور انجام PCR دو الیگونوکلئوتید کوتاه باید با مولکول DNA هیبرید شوند که هر کدام به یک رشته از مارپیچ دوتایی متصل می گردد. این الیگونوکلئوتیدها که به عنوان پرایمر برای واکنش های سنتز DNA عمل می نمایند حدود ناحیه ای را که باید تکثیر شوند را تعیین می کنند.
تکثیر معمولاً توسط آنزیم DNA پلیمراز I باکتری Thermus aquticus انجام می شود. این میکروارگانیسم در چشمه های آب گرم زندگی می کند و بسیاری از آنزیم های آن از جمله آنزیم Taq پلیمراز، به حرارت مقاوم هستند؛ یعنی این آنزیم ها به دناتوره شدن در مقابل تیمار حرارتی مقاوم هستند. داشتن پایداری حرارتی آنزیم Taq پلیمراز یک نیاز اساسی برای روش PCR است.
برای انجام واکنش PCR، DNA هدف با Taq پلیمراز، دو پرایمر الیگونوکلئوتیدی و مجموعه نوکلئوتیدها مخلوط می گردد. مقدار DNA هدف می تواند بسیار اندک باشد زیرا PCR روشی کاملاً حساس بوده و حتی در حضور یک مولکول منفرد نیز قابلیت انجام دارد. برای شروع واکنش، مخلوط حاصل را تا Cᵒ94 حرارت می دهیم. در این درجه حرارت پیوند های هیدروژنی که در ایجاد ساختار دوم رشته ای دخیل هستند شکسته شده و در نتیجه، DNA هدف به دو مولکول تک رشته ای تبدیل می شود. سپس دما به Cᵒ60-50 تقلیل می یابد که این امر منجر به برخی اتصالات مجدد بین دو رشته DNA هدف می شود؛ اما در عین حال، اجازه اتصال مولکول های پرایمر به جایگاه های اتصال را نیز می دهد. در این لحظه شرایط سنتز DNA مهیاست؛ بنابراین دما تا Cᵒ74 (زیر دمای بهینه Taq پلیمراز) افزایش داده می شود. در نخستین مرحله از PCR، یک مجموعه محصول بلند از روی هر رشته DNA هدف سنتز می شود. این پلی نوکلئوتیدها دارای انتهاهای 5َ مشابه اما 3َ تصادفی هستند که انتهای 3َ معرف محلی است که سنتز DNA به طور تصادفی در آنجا خاتمه می یابد. (‏شکل (3-2) )
حال چرخه دناتوره شدن – هیبرید شدن – سنتز را تکرار میکنیم، محصولات بلند قبلی دناتوره شده و چهار رشته حاصل در خلال سنتز DNA کپی می شوند. در این مرحله چهار مولکول دو رشته ای ایجاد می شود که دو تا از آن ها شبیه محصولات بلند چرخه اول و دو تای دیگر جدید هستند در خلال سومین چرخه، محصولات کوتاه ایجاد می شوند، محصولاتی که انتهاهای 5َ و 3َ هر دو منطبق بر محل اتصال پرایمر هستند. در چرخه های بعدی، تعداد محصولات کوتاه به صورت نمایی افزایش می یابد (هر سیکل دو برابر می شود) و این روند تا اتمام یکی از واکنشگرها ادامه می یابد این بدین معناست که پس از 30 چرخه، بالغ بر 130 میلیون محصول کوتاه خواهیم داشت که مشتق از تنها یک مولکول اولیه واکنش می باشد. در واقع این معادل چندین میکروگرم محصول PCR است که تنها از کمتر از چند نانوگرم DNA هدف بدست آمده است.
در پایان PCR معمولاً نمونه ای از مخلوط واکنش روی ژل آگارز، الکتروفورز و بررسی می شود. DNA به اندازه کافی تولید شده است که بتوان آن را پس از رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید به صورت نوار مشخصی روی ژل مشاهده کرد. مشاهده قطعه روی ژل ممکن است بتواند اطلاعات مفیدی درباره ناحیه تکثیر شده از DNA فراهم کند از طرف دیگر می توان محصول PCR را با روش های استاندارد مثل توالی یابی DNA مورد بررسی قرار داد.
طراحی پرایمر برای PCR
پرایمرها کلید موفقیت یا عدم موفقیت واکنش PCR هستند. اگر پرایمرها به طور صحیح طراحی شده باشند واکنش PCR منجر به تکثیر قطعه ای از DNA می شود که با ناحیه هدف مولکول الگو مطابقت دارد. اگر پرایمرها به طور صحیح طراحی نشوند واکنش با شکست روبرو خواهد شد از این رو باید به طراحی پرایمرها توجه زیادی کرد.
طراحی پرایمرها با توالی مناسب کار مشکلی نیست. آن ها باید با توالی دو سر ناحیه هدف روی مولکول الگو مطابقت داشته باشند. البته هر پرایمر باید مکمل (نه یکسان) رشته الگو باشد تا هیبرید شدن صورت گیرد و انتهای 3َ پرایمرهای هیبرید شده نیز باید به طرف همدیگر باشند. طول قطعه ای که باید تکثیر شود ترجیحاً نباید از kb3 بیشتر باشد و در بهترین حالت طول آن باید کمتر از kb1 باشد. قطعاتی با طول تا kb10 را می توان با روش های معمول PCR تکثیر کرد اما هرچه قطعات بزرگتر می شوند کارایی تکثیر کمتر می شود و بدست آوردن نتایج قابل تکرار با آن ها مشکل تر است تکثیر قطعات بسیار بلند تا kb40 با PCR قابل انجام است ولی نیازمند روش های خاصی است.
اولین موضوع مهمی که باید به آن اشاره نمود طول پرایمر است. اگر پرایمرها خیلی کوتاه باشند ممکن است با بخش های غیر اختصاصی هیبرید شوند و سبب تکثیر محصولات ناخواسته شوند. اگر پرایمرها خیلی بلند باشند کارایی PCR کاهش یافته لذا در عمل از پرایمرهای با طول بیش از 30-mers به ندرت استفاده می شود.
نکاتی که در طراحی پرایمر مد نظر داشتیم
پرایمر مورد طراحی قرار گرفته با واسطه سفارش به شرکت تکاپو زیست توسط توسط شرکت بیونییر کره جنوبی مورد سنتز قرار گرفت. خصوصیت و ماهیت پرایمرها در زیر مورد بحث قرار گرفتهاند؛
1- با توجه به اینکه طول متوسط هر پرایمر بین 30-18 جفت باز باشد، زیرا پرایمر با طول کوچک اتصال غیراختصاصی را افزایش داده و پرایمر بزرگ سرعت هیبریداسیون را کم می کند، پرایمر مستقیم و پرایمر معکوس هر دو 20 نوکلئوتید (20 mers) طراحی گردید.
2- مقدار G-C دو پرایمر با هم مشابه بوده و حدود 50 درصد باشد که GC Content برای هر دو پرایمر مستقیم و معکوس 45% در نظر گرفته شد.