دانلود پایان نامه
– نام، نام خانوادگی بیمار
– شماره شناسایی
– تاریخ
– زمان نمونه گیری (بخصوص درردیابی دوز درمانی داروها TDM)
– نام فرد خون گیر
سپس به علت بایاس اطلاعات، اقدام به کورسازی اطلاعات مندرج در روی نمونهها میکنیم، اطلاعات با کد دورقمی خاص تعویض گردید.
جمع آوری اطلاعات بیماران و افراد کنترل
به منظور اطلاع یافتن از وضعیت و مشخصات عمومی بیماران اطلاعات مربوط به تشخیص بالینی بیمار شامل سن و جنس و یافته های آزمایشگاهی و نتایج حاصل از CBC شامل شمارش گلبول های قرمز، سفید، پلاکت، هموگلوبین، هماتوکریت، بررسی گسترده خون محیطی و نتایج مربوط به سیتولوژی جمع آوری شد.
برای انتخاب افراد کنترل، از کودکانی استفاده شد که جهت بررسی وضعیت سلامت پیش از مدرسه خونی به آزمایشگاه مراجعه نموده بودند، اطلاعات افراد نرمال نیز که شامل سن، جنس و شمارش گلبول های سفید خون و MCV (حجم متوسط گلبول قرمز) وMCHC وMCHE، جمع آوری شد معیار ورود آنها به مطالعه داشتن MCV بین 80 تا 100، گلبول سفید خون بین 4000 تا 11000 بود که نشانگر وضعیت سلامت نرمال افراد میباشد.
ملاحظات اخلاقی
– به علت ملاحظات اخلاقی از اقدام به نمونهگیری فقط به منظور این مطالعه اجتناب شد، بهطوریکه از خون گرفتهشده به منظور بررسیهای دورهای کودکان تحت درمان استفاده گردید.
– اطلاعات شخصی افراد جمعیت مورد مطالعه محرمانه باقی مانده است.
– کلیه افراد مورد آزمایش مندرجات رضایت نامه از پیش طراحی شده را به صورت کامل و با علم به چگونگی نمونه گیری آن را بوسیله امضا تایید نمودند.
آمادهسازی بافیکوت برای استخراج DNA
جهت استخراج DNA به طور معمول از خون محیطی استفاده می شود. ضد انعقاد انتخابی برای استخراج DNA، EDTA است که در تحقیق حاضر مورد استفاده قرار گرفته است؛ چون از یک طرف با رسوب یون Ca2+ از انعقاد خون جلوگیری کرده از طرف دیگر با رسوب Mg2+ مانع از فعالیت DNase و تخریب DNA می شود. مقدار مصرف ضد انعقاد EDTA 50 میکرولیتر (5/0 مولار EDTA با PH=8 به ازای هر دو میلی لیتر خون) مورد استفاده قرار گرفت. بهترین دمای نگهداری خون کامل جهت استخراج DNA دمای 22 درجه سانتیگراد (دمای اتاق) است که حداکثر ظرف مدت 24 ساعت و در صورت نگهداری در 4 درجه سانتیگراد (در یخچال) به مدت یک هفته نگهداری بوده و سپس می تواند اقدام به استخراج DNA نمود.
جداسازی بافی کوت
به منظور جداسازی سلولها، نمونه ها به آزمایشگاه منتقل شد. بیشترین حجم DNA در لنفوسیتها میباشد که بر عکس آن RBC ها مقدار بسیار کمی DNA و میزان زیادی RNA و پروتئین دارد، به همین علت اقدام به استخراج گلبولهای سفید کردیم.
بدین منظور لوله حاوی مخلوط خون به مدت 5 دقیقه با 4000 دور در دقیقه سانتریفوژ گردید. از دستگاه سانتریفوژ یخچالدار برای جداسازی استفاده شد، زیرا کمترین آسیب (دناتوره شدن) به پروتئین ها و گلبولهای قرمز وارد می شود. پس از سانتریفوژ سه بخش کاملاً مجزا در لوله قابل رویت بود. بخش بالایی، پلاسما می باشد که حاوی 91% آب و 7% پروتئین دارد، 2% مواد محلول دیگر شامل آمینو اسیدها، قندها، لیپیدها، هورمون ها و الکترولیت ها می باشد. قسمت میانی خون شامل یک لایه باریک سفیدرنگ که بافی کوت نامیده می شود و حاوی گلبولهای سفید و پلاکتهاست. در ته لوله، گلبول های قرمز قرار می گیرند که حدود 50% از حجم تیوپ را اشغال میکند، بافی کوت که حاوی گلبول های سفید و پلاکت ها ست و تقریباً 5% از حجم خون را شامل میشود، نمونه مورد نیاز برای انجام بررسی های مولکولی است.
به علت ورود مقادیر متفاوتی از گلبول قرمز به همراه بافی کوت و نقش مهارکنندگی و اختلال پروتئین ها به خصوص هموگلوبین ها و نیز RNA در روند استخراج DNA، نیاز به لیز و خروج باقی مانده گلبول های قرمز ضروری می باشد که این امر با استفاده از آب دیونیزه و نقش آن با واسطه اختلاف شیب غلظت اسمزی زیاد و تورم متلاشی شدن گلبول ها به وقوع می پیوندد.
به کمک سمپلر، λ500 مایع بالایی (پلاسما) را خارج کرده و در یک میکروتیوب ریخته و در فریزر قرار می دهیم تا برای بررسی سرولوژیک ویتامین D مورد بررسی قرار گیرد. لایه نازک میانی که سفید رنگ است را با سمپلر بطور کاملاً استریل و با احتیاط خارج می کنیم و در میکروتیوب 5/1 می ریزیم. در این مرحله ممکن است مقداری گلبول قرمز نیز همراه بافی کوت وارد شود.
وجود گلبول قرمز در بافی کوت باعث ایجاد خطا در مراحل بعدی بخصوص استخراج DNA می شود. دو روش برای جدا کردن بافی کوت از گلبول قرمز وجود دارد، روش اول اینکه می توان در میکروتیوب حاوی بافی کوت آب مقطر استریل اضافه کرد آن را به مدت 24 ساعت در یخچال قرار داد تا در اثر پدیده تورژسانس گلبول های قرمز لیز شوند که می توان مایع رویی که حاوی گلبول های قرمز لیز شده است را خارج کرد. روش دوم اینکه به آن آب مقطر استریل اضافه (به اندازه ای که سر ریز شود) می کنیم، آن را با شیکر به طور کامل همگن نموده و در سانتریفوژ به مدت 4 دقیقه با 11000 دور در دقیقه قرار می دهیم. این کار را چند بار تکرار می کنیم تا محلول رویی کاملاً شفاف شده و هیچ گلبول قرمزی در آن وجود نداشته باشد. به این ترتیب بافی کوت جدا شده را تا مرحله استخراج DNA در یخچال نگهداری می کنیم.
روش دیگری نیز وجود دارد که استخراج بافیکوت و لنفوسیتها توسط فایکول است که البته در این مطالعه فقط جهت کنترل کیفیت روش فوق، چند نمونه مورد استخراج با فایکول نیز قرار گرفتند.