دانلود پایان نامه
تعیین دمای صحیح برای استفاده در PCR
در حین کار کردن با PCR واکنش بین سه دمای مختلف منتقل می شود.
دمای اتصال یکی از نقاط مهم است که می تواند در اختصاصی بودن واکنش تاثیر داشته باشد هیبرید شدن DNA- DNA یک پدیده وابسته به دما است. اگر دما بسیار بالا باشد هیچگونه هیبریداسیونی صورت نمی گیرد، در عوض، پرایمر و DNA الگو جدا از هم باقی می مانند؛ اما اگر دما پایین تر باشد هیبریدهای غیر اختصاصی پایداری تشکیل خواهد شد که در آن ها همه جفت بازها به طور صحیح تشکیل نشده اند. گر این اتفاق بیفتد محاسبات اولیه با توجه به طول مناسب برای پرایمرها بی اثر خواهد بود، چون که این محاسبات به نحوی انجام می شود که تنها هیبریدهای صحیح بین پرایمر – الگو قابل تشکیل باشند. اگر جفت های نادرست شکل گیرند، تعداد محل های بالقوه هیبرید شدن برای پرایمر افزایش می یابد و به احتمال زیاد تکثیر در محل های غیر هدف روی مولکول الگو صورت می پذیرد.
Tm دمایی است که در آن هیبریدهای دارای جفت باز صحیح از هم جدا می شوند (ذوب می شوند) دمای مناسب برای تشکیل هیبریدهای صحیح الگو و پرایمر باید 1 تا 2 درجه سانتی گراد پایین تر از دمای Tm باشد ولی این دما آن قدر زیاد است که هیبریدهای دارای حتی یک جفت باز اشتباه هم نتوانند پایدار بمانند Tm را به طور عملی می توان تعیین نمود ولی به طور معمول با فرمول ساده زیر محاسبه می شود.
Tm= (4[G+C])+(2[A+T]) Cᵒ
Tm= (4(9)+ 2(11))= 58Cᵒ
بر طبق فرمول گفته شده، Tm مطلوب Cᵒ58 بدست آمد البته در این دما باندهای غیر اختصاصی مشاهده گردید که از دستگاه ترموسایکلر گرادیانت استفاده شد تا دمای بهینه بدست آید. این دما در حدود Cᵒ61 مطلوب تشخیص دادهشد. 
در این فرمول، [G+C] تعداد نوکلئوتیدهای G و C و [A+T] تعداد نوکلئوتیدهای A و T موجود در توالی پرایمر را نشان می دهد. باید توجه داشت که دو پرایمر باید به نحی طراحی شوند که دارای Tm یکسانی باشند. اگر این مسأله در نظر گرفته نشود.
دزوکسی نوکلئوتید تری فسفات (dNTP)
در واکنش PCR، 4 نوع دزوکسی نوکلئوتید تری فسفات استفاده می شود شامل (dTTP, dCTP, dGTP, dATP) استفاده شد که از شرکت Fermentas خریداری شد، حاوی 100 میکرولیتر (غلظت اولیه 10 میلی مولار) از مخلوط هر 4 نوع نوکلئوتید بود. غلظت dNTP استفاده شده در هر واکنش 200 میکرومولار می باشد.
DNA پلیمراز مقاوم به حرارت
DNA پلیمراز زنجیره DNA را با استفاده از دزوکسی نوکلئوتیدهای تری فسفاته از روی DNA الگو انجام می دهد. در PCR از آنزیم DNATaq پلیمراز که از یک باکتری گرمادوست به نام ترموس آلواتیکوس که در چشمه های آب گرم زندگی می کند به دست می آید و در دمای Cᵒ94 کاملاً پایدار است و دمای اپتیمم فعالیت آن Cᵒ72 است.
آنزیم DNATaq پلیمراز از شرکت سیناژن تهیه گردید و حاوی 500 واحد آنزیم بوده است. غلظت آنزیم Unit/μ15 بوده که در هر واکنش 2/0 میکرولیتر (واحد) از آن استفاده شد. آنزیم Taq از حساس ترین اجزائ واکنش PCR است و همیشه تا قبل از استفاده در یخچال نگهداری می شود.
MgCl2
محلول پایه کلرید منیزیم با غلظت 50 میلی مول بدون رقیق نمودن مورد استفاده قرار گرفت مقدار مورد نیاز از محلول اصلی MgCl2 در واکنش PCR با حجم 50 میکرولیتر، 2 میکرولیتر بود. یون MgCl2 در PCR دو عمل مهم دارد.
1- به عنوان کوفاکتور آنزیم DNATaq عمل می کند.
2- با نوکلئوتیدها ترکیب شده و باعث تسهیل ورود نوکلئوتیدها در زنجیره DNA می شود. غلظت بالای Mg2+ باعث ایجاد باندهای غیر اختصاصی در الکتروفورز می شود.
بافر PCR
واکنش PCR در یک محیط بافری با PH مناسب انجام می شود: بافر PCR حاوی Tris- HCl و KCl با 4/8 = PH می باشد و به صورت غلظت 10 برابر (X10) عرضه می شود که در واکنش PCR غلظت نهایی آن به صورت X1 در می آید.
مراحل انجام PCR
وسایل و مواد مورد نیاز
1- دستگاه ترموسایکلر