γ> β> α است در حالی که عکس این حالت در دماهای بالا اتفاق می¬افتد. همچنین گزارش شده که در دماهای بالاتر تاثیر پروکسیدانی توکوفرول¬ها در غلظت¬های بالاتر کاهش می یابد که به دلیل قابلیت حل شدن اکسیژن در روغن¬ها می باشد. توکوفرول¬ها در چربی های حیوانی نسبت به روغن¬های گیاهی بیشتر مؤثرند و می توانند به وسیله این آنتی اکسیدان¬ها بهتر محافظت شوند (کاسیمیر و مین ، 2008). شکل 2-3- ساختار شیمیایی توکوفرول ها و توکوتری انول ها (کاسیمیر و مین، 2008) 2-6-3-2-2- اسید اسکوربیک و نمک های اسکوربات اسید اسکوربیک به عنوان یک آنتی اکسیدان به دلیل GRAS بودن و استفاده نامحدود آن قابل توجه است. در بافت های زنده اسید اسکوربیک از طریق اهداء اتم¬های هیدروژن به عنوان آنتی اکسیدان¬های اولیه عمل کرده و قادر است رادیکال ها را به طور مستقیم جذب نموده و هیدروپرکسیدها را به محصولات مقاوم تبدیل نماید. اسید اسکوربیک یک آنتی اکسیدان مهم در بافت های گیاهی است و برای جلوگیری از آسیب سلولی اکسیداتیو به وسیله پرکسید هیدروژن ضروری است. در غذاها اسید اسکوربیک به عنوان یک آنتی اکسیدان ثانویه با عملکرد چندگانه بوده و با جذب اکسیژن، پتانسیل اکسیداسیون احیاء سیستم های غذایی را تا محدوده احیاء بالا می برد. همچنین می تواند به عنوان یک سینرژیست با دادن اتم¬های هیدروژن به آنتی اکسیدان های اولیه همچون توکوفرول استفاده شود. اسید اسکوربیک و نمک¬های آن (سدیم اسکوربات و کلسیم اسکوربات) محلول در آب هستند (شکل 1-3) و از این رو قابل استفاده به عنوان آنتی اکسیدان برای روغن¬ها و چربی¬ها نیستند و به طور وسیعی از آنها برای پایدار کردن نوشیدنی¬ها استفاده می شود (کاسیمیر و مین، 2008). شکل 2-4- ساختار شیمیایی L- اسید اسکوربیک، اریتوربیک اسید و آسکوربیل پالمیتات(کاسیمیر و مین، 2008) 2-6-3-2-3- کاروتنوئیدها کاروتنوئیدها پیگمان¬های زرد، نارنجی و قرمز محلول در چربی هستند که در گیاهان سبز ، میوه¬جات و سبزیجات وجود دارند. کاروتنوئیدها می توانند به عنوان آنتی اکسیدان¬های اولیه با به دام انداختن رادیکال های آزاد و یا به عنوان آنتی اکسیدان¬های ثانویه با فرونشاندن اکسیژن یگانه عمل کنند. کاروتنوئید ها در غذا ها معمولا آنتی اکسیدان¬های ثانویه هستند و در غیاب اکسیژن یگانه (در فشار اکسیژن کم)، با به دام انداختن رادیکال های آزاد از اکسیداسیون جلوگیری می کنند و به عنوان آنتی اکسیدان¬های شکننده زنجیر عمل می کنند. کاروتنوئیدها خاموش کننده¬های خیلی موثری هستند و یک مولکول کاروتنوئید قادر است که با تعدادی اکسیژن یگانه واکنش دهد. کاروتنوئیدها دارای 9 یا تعدادی بیشتر باندهای دوگانه کنژوگه بوده و آنتی اکسیدان¬های مؤثری به شمار می آیند. درباره فعالیت آنتی اکسیدانی کاروتنوئیدها تحقیقات زیادی صورت گرفته است. گزارش شده که لوتئین ، لیکوپن ، بتا¬کاروتن از فتواکسیداسیون روغن های تصفیه شده جلوگیری می کنند. رنگ آناتو محتوی کاروتنوئید بیکسین است که دارای فعالیت آنتی اکسیدانی می باشد. ترکیب کاروتنوئیدها و توکوفرول¬ها با همدیگر به طور سینرژیستی عمل می کنند. بتاکاروتن به دلیل اینکه به آسانی در بیشتر حلال¬ها حل نمی شود و واکنش پذیری بالایی دارد، کمتر به عنوان آنتی اکسیدان به کار برده می شود. پایداری کاروتنوئیدها با اکسیژن، گرما، pH، نور و حضور فلزات تحت تاثیر قرار می گیرد. با بهبود پایداری کاروتنوئیدها می توان از آنها به طور وسیعی به عنوان آنتی اکسیدان استفاده کرد(کاسیمیر و مین، 2008). 2-6-3-2-4- فلاونوئید ها و اسیدهای فنولی واژه فنولی، متعلق به یک گروه وسیع و متنوعی از ترکیبات شیمیایی است. این ترکیبات می توانند به روش های مختلفی طبقه بندی شوند. هاربورن و سیموندس (1964) این ترکیبات را به گروه هایی بر اساس تعداد کربن های موجود در مولکول طبقه بندی کرد (جدول 1-3) (ورمریس و نیکولسون ، 2006). ترکیبات فنولی شامل فلاونوئیدها و اسیدهای فنولی تا فنول¬های با وزن مولکولی بالا یعنی تانن¬ها هستند. در ساختار تانن ها گروه های فنولی زیادی وجود دارد که این ترکیبات قادرند پروتئین¬ها را رسوب دهند. تانن ها در دانه های غلات، بقولات، میوه ها و نوشیدنی¬هایی مانند چای و قهوه وجود دارند. اسیدهای فنولی از نظر ساختار با فلاونوئیدها ارتباط داشته و به عنوان پیش سازهای بیوسنتزی آنها به کار برده می شوند و به مقدار قابل ملاحظه ای در غلات وجود دارند و از جمله آنها می توان اسیدهای فرولیک، کافئیک اسید، پاراهیدروکسی بنزوئیک ، پروتوکاتکوئیک ، پاراکوماریک ، وانیلیک و سیرینجیک را نام برد(اسکین و رابینسون، 2000). جدول 2-3- طبقه بندی ترکیبات فنولی (ورمریس و نیکولسون، 2006) ساختار طبقه 6 C فنول های ساده 1 C- 6C اسید های فنولی و ترکیبات وابسته 2 C- 6 C استوفنول ها و فنیل استیک اسید ها 3 C- 6 C اسید های سینامیک، سینامیل آلدهیدها، سینامیل الکل ها 15 C کالکون ها، اورون ها ، دی هیدروکالکون ها 15 C فلاوان ها 15 C فلاوون ها 15 C فلاوانون ها 15 C فلاوانونول ها 15 C آنتوسیانیدین ها 15 C آنتوسیانین ها 30 C بی فلاوونیل ها 6 C-2 C-6 C و 6 C-1 C-6 C بنزوفنون ها، گزانتون ها، استیلبن ها 6 C و 10 C و 14 C کینون ها (بنزوکینون ها، آنتراکینون ها، نفتوکینون ها) 18 C بتاسیانین ها لیگنان ها و نئولیگنان ها دی مرها و اولیگومرها لیگنین پلی مرها فلوبافن ها پلی مرها تانن ها اولیگومرها و پلی مرها فلاونوئیدها به عنوان متابولیت های ثانویه گیاهی به شمار می روند و مرکب از آنتوسیانین ها، کاتکین¬ها، فلاوون ها، فلاونول ها، ایزوفلاوون ها و پروآنتوسیانیدین ها هستند. تعدادی از فلاونوئیدها به دلیل توانایی در احاطه کردن فلزات دارای فعالیت آنتی اکسیدانی می باشند. فلاونوئیدها می توانند به عنوان آنتی اکسیدان های اولیه و جاذب های آنیون سوپراکسید عمل کنند. گزارش شده که این ترکیبات مسئول فعالیت آنتی اکسیدانی بسیاری از عصاره¬های گیاهان و ادویه¬ها هستند. فلاوون¬ها و فلاونول¬ها در میوه¬ها به صورت گلیکوزید وجود دارند. این ترکیبات در گیاهان، سبزیجات، چای و شراب غالب و متداول اند. کوئرستین یک آنتی اکسیدان بسیار مؤثر است و در سیستم¬های مدل اسید لینولئیک بسیار کارآمد می باشد (کاسیمیر و مین، 2008). آنتی اکسیدان¬های آنزیمی (گلوکز اکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز)، پروتئین ها و ترکیبات مشابه (آمین ها، آمینواسیدها، پپتیدها و محصولات هیدرولیز پروتئینی)، محصولات واکنش مایلارد، فسفولیپید ها، استرول ها، دی اکسید گوگرد و سولفیت های دیگر و صمغ¬ها از دیگر ترکیباتی هستند که دارای فعالیت آنتی اکسیدانی می باشند و در گروه آنتی اکسیدان¬های طبیعی طبقه بندی می شوند. 2-7- روش های استخراج ترکیبات موثره از گیاهان 2-7-1- روش سنتی استخراج 2-7-1-1- اصول و مکانیسم استخراج تکنیک¬های کلاسیک برای استخراج با حلال مواد موثره از ترکیبات گیاهی به نوع حلال انتخابی، حرارت و همزدن وابسته است. این روش ها عبارتند از : روش غرقابی، سوکسله، خیساندن و پرکولاسیون با یک مخلوط آب-الکل یا چربی داغ است. سوکسله یک روش استاندارد و مرجع اصلی برای ارزیابی اجرای دیگر روش-های استخراج جامد- مایع است. استخراج با سوکسله تکنیک ثابت شده ای است که به جز موارد محدودی همچون استخراج ترکیبات حساس به حرارت، نسبت به روش¬های استخراج دیگر برتری دارد. در مدتی که مواد گیاهی با حلال در تماس است، انتقال جرم ترکیب مورد نظر از ماده غذایی به حلال صورت می گیرد که این انتقال در سه مرحله انجام می گیرد: 1- ماده در حلال حل می گردد 2- محلول از داخل ماده غذایی به سطح حرکت می کند 3- محلول در حلال پخش می گردد. بنابراین زمان استخراج بایستی به حد کافی باشد تا حلال به خوبی حداکثر مقدار ماده را استخراج کند (وانگ و ولر، 2006). 2-7-1-2- جنبه های عملی برای روش سنتی استخراج برای استخراج مواد گیاهی مورد نظر با استفاده از روش سنتی استخراج ، باید یک حلال استخراجی مناسب انتخاب شود. حلال های مختلف، عصاره¬ها و ترکیبات عصاره¬ای مختلفی را استخراج می¬کنند. همچنین، استخراج با سوکسله به میزان زیادی به خصوصیات بافت گیاهی و اندازه ذرات وابسته است به عنوان مثال انتشار(دیفوزیون) درونی ممکن است مرحله محدود کننده در طی استخراج باشد. زمان استخراج عامل مهمی بوده و به چند عامل بستگی دارد: 1) حلالیت ماده درون حلال: بسته به نوع حلال استخراجی متفاوت است. 2) دمای استخراج: افزایش دما باعث افزایش سرعت استخراج می¬شود اما امکان تجزیه ترکیبات حساس به حرارت در دماهای بالا وجود دارد. 3) سطح تماس: سرعت انتقال جرم به طور مستقیم به سطح ماده غذایی بستگی دارد بنابراین هر چه ذرات مواد گیاهی ریزتر باشد سرعت استخراج افزایش می یابد. 4) سرعت جریان حلال : هر چه سرعت جریان حلال بیشتر باشد، باعث کاهش لایه مرزی در سطح مواد گیاهی شده و در نتیجه باعث افزایش سرعت استخراج می گردد. کاربرد¬های صنعتی گسترده، قابلیت تجدید، کارایی بهتر و امکان دستکاری کمتر در عصاره استخراجی، از مزیت های استخراج با سوکسله نسبت به دیگر روش های نوین استخراج هستند. با این حال در مقایسه با روش¬های نوین استخراج، سوکسله یک روش قدیمی است و مصرف حلال بالایی داشته و نیاز به زمان زیادی دارد. اخیراً سمیت بعضی حلال های مورد استفاده در روش سوکسله مورد سوال قرار گرفته است. 2-7-2- روش استخراج به کمک اولتراسوند (UAE) 2-7-2-1- اصول و مکانیسم استخراج امواج صوتی که فرکانس های بالاتر از 20 کیلو هرتز دارند، نوسان¬های میکانیکی در یک ماده جامد، مایع و گاز ایجاد می¬کنند. برخلاف امواج الکترومغناطیسی، امواج صوتی باید در یک ماده پخش شوند و دارای چرخه¬های انبساط و انقباض در طی پخش در محیط می باشند. انبساط باعث افزایش فاصله مولکولی شده و انقباض آنها را با هم تحت فشار قرار می دهد. در حالت انبساط، حباب هایی در یک مایع ایجاد می¬شود و فشار منفی تولید می کند. حباب¬های تشکیل شده، رشد و در نهایت متلاشی می¬شوند (پدیده کاویتاسیون ). دو طرح کلی استخراج کننده¬های همراه با اولتراسوند، حمام¬های اولتراسوند و سیستم پروب اولتراسوند است. تاثیرات میکانیکی اولتراسوند، باعث نفوذ بیشتری از حلال به درون مواد سلولی شده و انتقال جرم را بهبود می دهند. اولتراسوند در طی استخراج می تواند همچنین دیواره های سلولی را تخریب کند و باعث تسهیل آزاد سازی محتوای آن شود. بنابراین، تخریب سلولی کارآمد و انتقال جرم موثر، دو فاکتور اصلی هستند که باعث افزایش استخراج با اولتراسوند می¬شود. برخلاف استخراج کننده¬های معمولی، عصاره های گیاهی در اثر اولتراسوند، از عرض دیواره¬های سلولی انتشار پیدا کرده و باعث پاره شدن دیواره سلولی در زمانی کوتاهتر می¬شود (ویلخا و همکاران، 2008). 2-7-2-2- جنبه های عملی برای استخراج به کمک اولتراسوند برای دستیابی به یک استخراج مناسب با اولتراسوند، در نظر گرفتن بعضی ویژگی¬های گیاهان همچون مقدار رطوبت، اندازه ذرات و حلال مورد استفاده برای استخراج ضروری می¬باشد. علاوه بر این فاکتور های زیادی شامل فرکانس، فشار، دما و زمان، مکانیسم عمل اولتراسوند را تحت تاثیر قرار می¬دهند (وانگ و ولر ، 2006). فرکانس اولتراسوند تاثیرات زیادی روی بازده و سرعت استخراج دارد. همچنین اثرات اولتراسوند روی بازده و سرعت استخراج اولتراسوند بسته به ماهیت مواد گیاهی استخراجی فرق می کند. پراکنش امواج اولتراسوند درون یک استخراج کننده پارامتر کلیدی در طراحی استخراج کننده¬های اولتراسوند است. حداکثر قدرت اولتراسوند در پیرامون سطح منتشر کننده پروب اولتراسوند مشاهده می¬شود. شدت اولتراسوند به طور ناگهانی با افزایش فاصله از سطح منتشر کننده و همچنین با افزایش حضور ذرات جامد کاهش می یابد. به منظور جلوگیری از توقف امواج یا تشکیل نواحی آزاد جامد برای عبور بهتر امواج اولتراسونیک، معمولاً از عمل همزدن یا تکان دادن استفاده می¬شود (ویناترو و همکاران، 1997). استخراج به کمک اولتراسوند یک روش ساده بوده و جایگزین مناسبی برای روش های سنتی استخراج است. فواید اصلی استفاده از اولتراسوند در استخراج جامد-مایع شامل افزایش بازده استخراج و سرعت استخراج است. اولتراسوند می تواند دمای عملیاتی را کاهش دهد و امکان استخراج ترکیبات حساس به حرارت را فراهم سازد. در مقایسه با تکنیک¬های استخراج جدید دیگر همچون استخراج با مایکروویو، دستگاه اولتراسوند ارزان تر است و اجرای آن راحتتر می¬باشد. استخراج به کمک اولتراسوند مشابه استخراج با سوکسله می تواند با هر حلالی برای استخراج دامنه وسیعی از ترکیبات طبیعی استفاده شود (وانگ و ولر، 2006). 2-8- مروری بر پژوهش های انجام شده نگرو و همکاران (2003) در آزمایشی که برروی تفاله انگور قرمز در ایتالیا انجام شد مقدار ترکیبات کل فنلیک تفاله 161 گرم در کیلوگرم ماده خشک گزارش نمودند. پکیک و همکاران (1998) مخلوط اتیل استات و آب را بعنوان بهترین حلال برای استخراج ترکیبات فنلی از هسته انگور معرفی کردند، زیرا این ترکیب بخشی از ترکیبات فنلی که در بخش چرب غذا قابلیت حل شدن دارند را استخراج می کند و همچنین به علت نقطه جوش پایین به سهولت قابل جداسازی می¬باشد. کاراکبی و همکاران (2008) ترکیب 70 – 50 % آب و اتانول و دمای 84 درجه سانتی¬گراد را شرایط بهینه برای استخراج trans-resveratrol و اسید فرولیک از ساقه انگور معرفی کردند. روزبهان و همکاران (1387) گزارش کردند که تفاله انگور قرمز (واریته سیاه سردشت) منبع خوبی از آنتی اکسیدان¬های طبیعی است و غلظت ppm 350 از این آنتی اکسیدان دارای کارایی خوبی در کند نمودن روند اکسیداسیون روغن خام سویا بوده است. ابوطالبیان (1385) برای استخراج ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی از گیاهان نعناع، پونه و ریحان از سه حلال آب، متانول 80% و اتانول 80% استفاده کرد و حلال متانول به عنوان بهترین حلال انتخاب شد. این محقق میزان استخراج ترکیبات فنولی با استفاده از متانول 80% را به ترتیب 16/58، 32/67 و 83/23 میلی گرم معادل اسید تانیک در وزن خشک گیاه و ترکیبات فلاونوئیدی به ترتیب 8/52، 17/51 و 19/45 میلی گرم معادل اپی کاتکین در وزن خشک گیاه گزارش کرد. گلی و همکاران (2005)، نشان دادند که در میان روش¬های استفاده شده برای استخراج ترکیبات فنولیک از پوست سبز پسته، روش استفاده از حلال آب به همراه امواج اولتراسونیک و آب به تنهایی دارای بالاترین درصد استخراج ترکیبات فنولیک بودند، البته درصد استخراج با استفاده از این دو روش تفاوت معنی داری با روش استفاده از حلال متانول و امواج اولتراسونیک نداشت. بامداد (1382) میزان ترکیبات فلاونوئیدی در زیره سیاه و میخک را به ترتیب 60/2 و 5 میلی گرم در گرم وزن خشک گزارش کرد. احمدی و همکاران (2007) گزارش دادند که میزان کل ترکیبات فلاونوئیدی در کرفس کوهی 595/0 میلی گرم در وزن خشک است و نسبت کل فلاونوئیدها به کل ترکیبات فنولیک محاسبه شده 58% بود. عربشاهی و اروج (2007)، از سه حلال متانول، آب و استون برای بررسی خصوصیات آنتی اکسیدانی برگ های شاه توت استفاده کردند که حلال متانول بیشترین میزان ترکیبات فنولی(32/9 گرم اسید گالیک در 100 گرم عصاره خشک) را استخراج کرد. سینگ و همکاران (2002)، 3 حلال مختلف(آب، متانول و اتیل استات) را برای استخراج ترکیبات فنولیک از پوست و دانه انار استفاده نمودند که در این تحقیق متانول بیشترین بازده را نشان داد. اوزتورک و همکاران (2007)، از دو حلال متانول و کلروفرم برای بررسی فعالیت آنتی اکسیدانی ریشه و ساقه Rheum ribes استفاده کردند. عصاره کلروفرمی ریشه میزان ترکیبات فلاونوئیدی بیشتری را در مقایسه با عصاره متانولی(59/145 در برابر 23/16 میکروگرم معادل کوئرستین به میلی گرم عصاره) استخراج کرد. میزان ترکیبات فنولی نیز به ترتیب 66/48 و 91/25 میکروگرم پیروکاتکول به میلی گرم عصاره گزارش شد. میزان این ترکیبات در هر دو عصاره برای ساقه اختلاف کمی داشت. همچنین عصاره کلروفرمی ریشه فعالیت بهتری از استاندارد کوئرستین در سیستم بتاکاروتن- اسید لینولئیک برای جلوگیری از پراکسیداسیون لیپید نشان داد. در بررسی فعالیت آنتی اکسیدانی و استخراج ترکیبات فنولی از کاه گندم از حلال هایی همچون اتانول، اتانول 70% آبی، متانول 70% آبی و استون 50% آبی استفاده شده است که حلال استون 50% آبی بیشترین مقدار ترکیبات فنولیک را از کاه گندم استخراج کرد (زو و یو ، 2004). همچنین استخراج ترکیبات فنولی از قارچ خوراکی با استفاده از 4 نوع حلال (آب، متانول، اتیل استات و پترولیوم اتر) صورت گرفت که عصاره آبی دارای بیشترین مقدار ترکیبات فنولیک بود (چونگ و همکاران، 2003). روش سوکسله، روش معمول برای استخراج این ترکیبات می¬باشد که راندمان آن به نوع حلال نیز بستگی دارد ولی عمدتاً از آب، متانول، اتیل استات و دی اتیل اتر برای استخراج پلی فنل ها استفاده گردیده است. برای استخراج با سوکسله مزایایی همچون تماس کامل نمونه و حلال در طول مرحله استخراج، عدم نیاز به روش فیلتراسیون و استفاده ساده و مناسب باید مد نظر باشد. اجزای جانبی همچون یک پمپ خلا، یک واحد جداسازی غشایی، یک منبع اولتراسوند یا مایکروویو و سیال فوق بحرانی می تواند با روش سوکسله به منظور بهبود اجرای آن ترکیب شود (وانگ و ولر، 2006). واتم و همکاران (2003) گزارش کردند که اغلب ترکیبات پلی فنلی موجود در سیب به صورت باند شده با کربوهیدرات¬هایی مانند گلیکوزیدها هستند و این موضوع باعث کاهش کارایی آنها بعنوان آنتی اکسیدان می گردد.برخی از قارچ¬ها در طی تخمیر پسماندهای لیگنوسلولزی آنزیم¬های متابولیسمی تولید می¬کنند و در نتیجه فعالیت این آنزیمها ترکیبات فنلی آزاد می¬گردند. آجیلا و همکاران (2011) برای بهبود میزان استخراج آنتی اکسیدان¬های تفاله سیب از تخمیر توسط قارچ فانروچیت کریزوسپوریوم بهره گرفتند. نتایج حاصل نشان داد تفاله¬های تخمیر شده دارای مقادیر بالاتر ترکیبات فنلی بوده و اثرات آنتی اکسیدانی قویتری نسبت به تفاله¬های تخمیر نشده نشان دادند. از تخمیرهای میکروبی محصولات متنوعی بدست می آید. وانگ و همکاران (2007) گزارش کردند که دوچی نوعی محصول چینی تخمیر شده توسط آسپرژیلوس اریزه منبعی خوبی از آنتی اکسیدان¬های طبیعی است. لین و همکاران (2006) گزارش کردند که غلظت بالایی از ترکیبات فنلی از سویای تخمیر شده توسط آسپرژیلوس اریزه نسبت به نمونه تخمیر نشده بدست آمد. دالجیت سینگ و همکاران (2011) شرایط بهینه فعالیت آنتی اکسیدانی آسپرژیلوس فومیگاتوس را 5% ساکارز، 05/0 % نیترات سدیم و دمای انکوباسیون 35 درجه سانتی¬گراد معرفی کردند. کاربرد اولتراسونیک به عنوان یک تکنیک آزمایشگاهی برای استخراج مواد گیاهی به طور وسیعی بررسی شده است. چندین مقاله مروری قبلا درباره استخراج متابولیت های موجود در ریشه گیاهان، فلاونوئیدها از غذاها با استفاده از طیفی از حلال ها و مواد فعال زیستی از گیاهان منتشر شده است. دامنه کاربرد های استخراج منتشر شده شامل مواد گیاهی، روغن، پروتئین و ترکیبات فعال زیستی از مواد گیاهی هستند(ویناترو2، 2001). با استفاده از اولتراسوند می توان تغییراتی را در شرایط فرآیند همچون کاهش دما و فشار در مقایسه با روش معمولی استخراج ایجاد کرد. رومهان و گوردون (2002) بیان کردند برای استخراج پایرترین از گل های Pyrethrum با حلال هگزان بدون اولتراسوند، بازده استخراج با دمای استخراج افزایش یافت و حداکثر بازده در c˚66 به دست آمد. در حالی که با اولتراسوند، چنانچه استخراج بهینه در محدوده دمایی c˚40 تا66 اتفاق بیافتد، تاثیر دما در این محدوده روی بازده استخراج قابل اغماض است. بنابراین استفاده از روش استخراج با اولتراسوند برای ترکیبات حساس به حرارت مناسب می¬باشد زیرا ممکن است در شرایط عملیاتی سوکسله به دلیل دمای استخراج بالا، تغییر کرده باشند. با این حال باید توجه نمود زمانی که اولتراسوند حرارت تولید می کند، باید به دقت دمای استخراج را کنترل کرد. زمان سونیکاسیون نیز باید به دقت مورد توجه باشد زیرا سونیکاسیون زیادی می تواند به کیفیت عصاره ها آسیب بزند (رومهان و گوردون، 2002). روش اولتراسوند برای استخراج مواد موثره ای همچون اسانس ها، روغن ها و پلی فنل ها از گیاهان استفاده شده است (ویلخا و همکاران، 2008). اولتراسوند می تواند بازده استخراج را افزایش دهد. شارما و گاپتا (2004) گزارش کردند که اولتراسونیکاسیون یک پیش تیمار حیاتی بوده و باعث افزایش راندمان استخراج روغن ها از بادام، زردآلو و سبوس برنج گردیده است. برای استخراج ساپونین از جینسنگ به کمک اولتراسوند، بازده کل و بازده ساپونین استخراجی به ترتیب 15 و 30% افزایش یافت. اولتراسوند همچنین می تواند سرعت های استخراج را افزایش و کیفیت عصاره ها را بهبود دهد(هیو و همکاران، 1994). سرعت های استخراج کاروون و لیمونن با روش استخراج به کمک اولتراسوند با استفاده از هگزان بسته به دمای به کار رفته، 3/1 تا 2 برابر سریعتر از روش های استخراج معمولی بود. بنابراین بازده و کیفیت کاروون بدست آمده بهتر از روش معمولی بود. استفاده از اولتراسوند، زمان استخراج را به حداقل نصف زمان مورد نیاز با روش های استخراج معمولی بدون هر گونه تغییر در ترکیب روغن¬های استخراجی کاهش داد(چمات و همکاران، 2004). وو و همکاران(2001) دریافتند که استخراج ساپونین های جینسینگ با اولتراسوند تقریبا سه برابر سریعتر از روش استخراج سوکسله انجام گرفت. استخراج به کمک اولتراسوند همچنین به عنوان یک روش مناسب برای استخراج ترکیبات فعال زیستی از گیاه Solvia officinalis و گل های Hibiscus tiliaceus ، آنتی اکسیدان¬ها از گیاه رزماری و استروئیدها و تری ترپن ها از Chresta spp بود (وانگ و ولر، 2006). افزایش بازده استخراج با روش اولتراسوند در مقایسه با روش های کلاسیک در آب و اتانول برای رازیانه، رازک ها، گل جعفری و نعناع به ترتیب 34% ، 12% ، 3% و 7% بود (ویناترو، 2001). وجود تغییرات در درصد بازده استخراج عمدتاً به دلیل ساختار ویژه محصول است. آلبو و همکاران (2004) تاثیر حلال های مختلف و اولتراسوند را بر استخراج اسید کارنوسیک از رزماری بررسی کردند. استفاده از روش استخراج همزنی معمولی با اتانول به طور معنی داری در مقایسه با اتیل استات و بوتانون تاثیر کمتری داشت. کاربرد اولتراسوند، عملکرد نسبی اتانول را در مقایسه با دو حلال دیگر بهبود داد. بنابراین عمل اولتراسونیکاسیون ممکن است وابستگی به یک حلال را کاهش داده و قابلیت استفاده از حلال¬های جایگزین را که از نظر اقتصادی، محیطی، سلامتی و ایمنی مناسب اند، فراهم سازد. آنتراکینون¬های حاصل از ریشه Morinda citrifolia ترکیبات فعالی هستند که تاثیرات درمانی از خود نشان داده و در کاربرد های دارویی ضد سرطانی استفاده می شوند. همویمول و همکاران (2006) استفاده از روش استخراج با اولتراسوند را برای بهبود ضریب استخراج آنتراکینون ها از ریشه M.citrifolia با حلال تحقیق کردند. استخراج با اولتراسوند در یک سیستم آب- اتانول ، 75% کاهش را در زمان و بازده استخراج در مقایسه با نمونه های غیرسونیک شده ایجاد کرد. راستاقنو و همکاران (2003) استخراج ایزوفلاوون¬ها را از سویا با اولتراسوند ارزیابی کردند که ضریب استخراج تا 15% بهبود یافته بود اما راندمان استخراج به حلال آلی مورد استفاده وابسته بود. مخصوصا، 40- 60 % آب برای بهبود ضریب استخراج لازم بود که به دلیل قطبیت نسبی ایزوفلاوون¬ها بود. روسانگلا و همکاران (2007)، ترکیب شیمیایی عصاره¬های چای مت (برگ های Ilex paraguariensis) را تحقیق کردند. تاثیر تیمار اولتراسونیک منجر به بهبود بازده میزان کافئین و اسید پالمیتیک در حلال متانول شد. در مطالعه ای که توسط وانگ و همکاران (2008) بر روی بهینه سازی شرایط استخراج ترکیبات فنولی از پوسته گندم با استفاده از حمام اولتراسوند صورت گرفت، بهترین شرایط استخراج، غلظت اتانول 64%، دمای 60 درجه سانتی¬گراد و زمان 25 دقیقه گزارش شد که زمان استخراج بیشترین پارامتر معنی دار برای فرایند بود. تحت این شرایط مقدار کل ترکیبات فنولیک، 12/3 میلی گرم معادل اسید گالیک به گرم پوسته گندم گزارش شد. در تحقیقی که مارتینو و همکاران (2006) بر روی گیاه شبدر(Melilotus officinalis) انجام دادند تاثیر روش مایکروویو، اولتراسوند و سوکسله را بر روی استخراج کومارین و ترکیبات مشابه بررسی نمودند. بهترین نتایج برای روش مایکروویو (با اتانول آبی 50% ، دو سیکل حرارت دهی 5 دقیقه ای و دمای 50 درجه سانتی¬گراد با سیستم مایکروویو محفظه بسته) بدست آمد. همچنین در بررسی زمان¬های مختلف (10 تا 180 دقیقه) و حلال های مختلف (اتانول50 %، متانول50% و آب جوش) بر روی استخراج این ترکیبات با استفاده از حمام اولتراسوند بهترین حالت برای زمان 60 دقیقه و با حلال اتانول آبی 50% بود که در مقایسه با روش سوکسله، راندمان استخراج بالاتری داشت. شوتیپراک و همکاران (2001) امکان استفاده از اولتراسوند را برای استخراج منتول از گیاه نعناع و جایگزینی با روش استخراج معمولی مطالعه کردند. نتایج نشان داد که گیاهان اولتراسونیک شده به مدت یک ساعت در دمایc˚22 در یک حمام اولتراسوند40 کیلو هرتز ، تقریبا 8/17 میکروگرم منتول در هر گرم بافت برگ آزاد کردند(2% کل محصول). مقدار منتول آزاد شده با زمان تیمار افزایش یافت و به میزان زیادی به وسیله دمای حمام آب اولتراسونیک تحت تاثیر بود. زمانی که دما از c˚22 به 39 افزایش یافت، میزان منتول استخراجی از 2% کل محصول به 12% افزایش یافت. بدون در نظر گرفتن تاثیرات دمایی ، معلوم شده که مکانیسم آزادسازی محصول به دلیل کاویتاسیون می¬باشد. فلاونوئیدها گروهی از ترکیبات پلی فنولی می باشند که در سلسله¬ی گیاهی گسترش وسیعی دارند و همچنین ساختمان آنها متفاوت است. ثابت شده است که فلاونوئیدها فعالیت ضداکسایشی از خود نشان میدهند و تاثیر آنها روی تغذیه و سلامتی انسان قابل ملاحظه است. سازوکار عمل فلاونوئیدها از طریق فرایندهای جاروب کنندگی یا شلاته کردن است (کسلر و همکاران، 2003) ترکیباتی مانند فلاونوئیدها که دارای گروه¬های هیدروکسیل هستند، مسئول جاروب کنندگی رادیکال آزاد در گیاهان هستند (داس و همکاران، 1990). مطالعات زیادی در مورد محتوای فلاونوئیدی در گیاهان مختلف انجام شده است. استفاده از آنتی اکسیدان¬های طبیعی برای بهبود پایداری اکسیداتیو روغن های خوراکی بسیار مورد توجه قرار گرفته است که به دلیل شناخته شدن عوارض نامطلوب آنتی اکسیدان های سنتزی می¬باشد. تحقیقات زیادی در پایداری روغن های خوراکی با آنتی اکسیدان¬های طبیعی از منابع گیاهی مختلف صورت گرفته است. گلی و همکاران (2005)، غلظت های مختلف ترکیبات فنولیک موجود در پوست پسته را در مقایسه با آنتی اکسیدان¬های سنتزی در روغن سویا بررسی کردند. نتایج آنها نشان داد که غلظت های مختلف ترکیبات فنولیک قادرند به خوبی روند اکسیداسیون را کند نمایند و اثر عصاره¬ها در غلظت 600 پی¬پی¬ام مشابه اثر آنتی اکسیدان-های سنتزی در غلظت 200 پی¬پی¬ام است. ابوطالبیان (1385) گزارش کرد که اثر آنتی اکسیدانی نعناع، پونه و ریحان در روغن آفتابگردان به عنوان آنتی اکسیدان در غلظت 600 پی¬پی¬ام با اثر آنتی اکسیدانی BHT در غلظت 200 پی¬پی¬ام قابل قیاس است و در میان گیاهان استفاده شده عصاره استخراجی از گیاه پونه بالاترین اثر آنتی اکسیدانی را از خود نشان داد و به دنبال آن گیاهان نعناع و ریحان قرار گرفتند. بامداد (1382) گزارش کرد که اثر آنتی اکسیدانی زیره سیاه و میخک در روغن آفتابگردان به عنوان آنتی اکسیدان با اثر آنتی اکسیدانی BHT برابر است. احمدی و همکاران (2007) گزارش کردند که عصاره متانولی کرفس کوهی به خوبی توانست اکسیداسیون را در روغن آفتابگردان به تاخیر بیندازد و از این نظر با آنتی اکسیدان سنتزی BHT قابل مقایسه می¬باشد. صمدلویی و همکاران (1386) در بررسی اثر آنتی اکسیدانی ترکیبات فنولی هسته انار بر روغن سویا گزارش کردند که ترکیبات فنولی هسته انار بین 2/0 تا 02/1 درصد متغیر بوده و اثر آنتی اکسیدانی آن در سطح 350 پی¬پی¬ام معادل با آنتی اکسیدان¬های سنتزی (BHA) در سطح 200 پی¬پی¬ام می¬باشد. در بررسی فعالیت آنتی اکسیدانی اسانس آویشن شیرازی در روغن سویا، شهسواری و همکاران (1387) گزارش کردند که در آزمون آون، اسانس آویشن شیرازی در غلظت 1/0% دارای اثر آنتی¬اکسیدانی معادل با BHA در غلظت 02/0% در روغن سویا بود. عبدا… و روزن (1999)، اثر آنتی اکسیدانی عصاره مریم گلی را در روغن آفتابگردان بررسی کردند. عصاره مریم گلی در غلظت 1200 پی¬پی¬ام بالاترین فعالیت آنتی اکسیدانی را نشان داد و فعالیت آن قابل قیاس با آنتی اکسیدان سنتزی BHT در غلظت 300 پی¬پی¬ام بود. عصاره¬های متانولی یولاف (03/0 – 01/0 %)، حفاظت بهتری از روغن سویا در تاریکی در دمای 60 درجه سانتی¬گراد نسبت به TBHQ داشتند (تین و وایت ، 1994). بنابراین در امولسیون¬های روغن سویا، عصاره یولاف بسیار مناسبتر از TBHQ به عنوان یک آنتی اکسیدان است، که این به دلیل وجود ترکیباتی با قابلیت حل پذیری در سیستم های مختلف در یولاف است که توان حل پذیری در هر دو فاز روغن و آب را دارند در حالی که TBHQ تنها در فاز روغنی محلول است. داه (1999)، فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره آبی 4 واریته از گل مینا را بر روی روغن سویا مورد بررسی قرار داد. نتایج نشان داد که عصاره های 02/0 % از هر 4 واریته فعالیت آنتی اکسیدانی بیشتری از توکوفرول 02/0 % و BHA 02/0 % داشت. فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره متانولی و کلروفرمی رزماری در روغن زیتون و کنجد در دمای 55 درجه سانتی¬گراد با اندازه گیری عدد پراکسید آزمایش شد. غلظت 1/0% و 2/0% عصاره و اسید سیتریک در این آزمون به کار برده شد. عصاره ها در مقایسه با نمونه های کنترل در روغن زیتون و کنجد اثر آنتی اکسیدانی بالایی از خود نشان دادند. عصاره کلروفرمی با غلظت 2/0% در روغن کنجد موثرترین غلظت در آزمایش بود (پوکورنی و کورزاک، 2001). چونگ و همکاران (2003)، اثر آنتی اکسیدانی عصاره حاصل از قارچ خوراکی را با آنتی اکسیدان سنتزی TBHQ مقایسه کردند و به این نتیجه رسیدند که آنتی اکسیدان سنتزی TBHQ در غلظت 2 میلی گرم در میلی لیتر اثر بیشتری از عصاره در غلظت 20 میلی گرم در میلی لیتر داشته است. زندی وگوردون (1380)، اثر آنتی اکسیدانی عصاره گیاه سالویا را مورد بررسی قرار دادند و با آنتی¬اکسیدان-های عصاره گیاهی مریم گلی، آکلیل کوهی و TBHQ مقایسه نمودند، نتایج نشان داد که غلظت 02/0 % آنتی اکسیدان سنتزی TBHQ و 1/0 % مریم گلی و پس از آن غلظت 1/0 % آکلیل کوهی بیشترین اثر را در به تاخیر انداختن اکسیداسیون داشته است. 2-9- فرضیه ها فرایند تخمیر توسط آسپرژیلوس اوریزه باعث افزایش قابل توجه در میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی حاصل می گردد. انگور دارای ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی است و استفاده از عصاره آن می تواند در جلوگیری از اکسیداسیون مواد غذایی از جمله روغن کره محلی موثر باشد. افزودن پودر آب پنیر به تفاله انگور باعث بهبود شرایط تخمیر شده و تاثیر مثبت در استخراج آنتی اکسیدانها دارد. راندمان استخراج ترکیبات فنلی بر حسب غلظت حلال متفاوت است. راندمان استخراج ترکیبات فنلی بر حسب میزان دمای استخراج متفاوت است. راندمان استخراج ترکیبات فنلی بر حسب میزان زمان استخراج متفاوت است. تکنیک اولتراسوند باعث افزایش میزان استخراج ترکیبات فنلی و کاهش زمان استخراج می گردد. فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره تفاله انگور تاثیر مشابه آنتی اکسیدانهای سنتزی در روغن کره محلی دارد. 2-10- اهداف در سال های اخیر تحقیقات زیادی روی استخراج آنتی اکسیدان¬های طبیعی از منابع گیاهی انجام گرفته است. یکی از این منابع که امکان بررسی و مطالعه بیشتر از نظر فعالیت آنتی اکسیدانی و میزان ترکیبات فنولی برای آن وجود دارد میوه انگور است. با توجه به در دسترس بودن تفاله انگور در کارخانجات تولید آبمیوه و کنسانتره در ارومیه و پتانسیل بالا از نظر فعالیت آنتی اکسیدانی آنها و تاثیر فرایند تخمیر در افزایش فعالیت آنتی اکسیدانی، هدفی که از اجرای این پایان نامه دنبال می¬شود ، مقایسه تاثیر تخمیر و شرایط مختلف استخراج از نظر میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی و ارزیابی عصاره حاصله بعنوان آنتی اکسیدان طبیعی در سیستم مدل (توانایی به دام اندازی رادیکال DPPH) و استفاده از آن در روغن کره محلی بعنوان آنتی اکسیدان طبیعی در مقایسه با آنتی اکسیدان¬های سنتزی می¬باشد. فصل 3 (مواد و روشها) 3-1- مواد مصرفی 3-1-1- تفاله انگور میوه انگور رقم ریش بابا از مرکز تحقیقات کشاورزی استان آذربایجان غربی در سال 1392 تهیه شد. جهت آماده سازی، ابتدا نمونه ها آب گیری و سپس تفاله ها در دمای 70 درجه سانتی¬گراد به مدت 5 ساعت روی سینی¬های مخصوص آون گسترانیده شده و خشک گردیدند. تفاله خشک شده توسط دستگاه پودر کننده juicer/blender (Panasonic-solid state control japan) پودر و در فریزر با دمای 18- درجه سانتی¬گراد تا زمان آزمایش نگهداری شدند. 3-1-2- پودر آب پنیر پودر آب پنیر که در این تحقیق به منظور تأمین برخی از ریزپپتیدها و ریزمغذی ها مورد استفاده قرار گرفت، از شرکت سانا خریداری شد که آنالیز ترکیبات آن به شرح جدول 3-1 می¬باشد. جدول 3-1- مشخصات فیزیکوشیمیایی پودر آب پنیر ویژگی¬های فیزیکوشیمیایی میزان (%) رطوبت 4-8/3 پروتئین 36-5/34 چربی 84/3-5/3 اسیدیته 02/0-01/0 pH لاکتوز 4/6-6 7 3-1-3- میکروارگانیسم در این تحقیق از کپک آسپرژیلوس اوریزه استفاده شد که توانایی آن در افزایش سطح ترکیبات فنلی قابل استخراج در منابعی که بررسی شده بود مورد تأیید بود، کپک آسپرژیلوس اوریزه PTCC No.5163 از مرکز کلکسیون قارچ و باکتری سازمان پژوهش های علمی و صنعتی به صورت لیوفلیزه خریداری شد و در شرایط آزمایشگاهی استریل و توسط محیط کشت نوترینت براث فعال شد. کپک آسپرژیلوس اوریزه سپس به محیط کشت مالت اکسترکت آگار منتقل شد و در دمای 24 درجه سانتی¬گراد به مدت 10-7 روز گرماخانه گذاری گردید. 3-1-4- مواد شیمیایی مواد شیمیایی مصرفی برای انجام این کار پژوهشی در جدول 3-2 عنوان گردیده است. جدول 3-2: مواد و ترکیبات مصرفی مورد استفاده در تحقیق نام ماده شرکت سازنده DPPH Sigma Folin-Ciocalteau Sigma متانول 99% Merck اتانول 90% Merck اتانول 70% Merck TPTZ Sigma سولفات آهن Merck کلرید آهن Merck اسید کلریدریک Merck کلرید آلومینیوم Merck نیتریت سدیم Merck اسید گالیک Fluka کوئرسیتین Fluka TBHQ Sigma 3-2- تجهیزات مورد استفاده برای انجام این طرح پژوهشی از تجهیزات و دستگاه‌هایی به شرح جدول3-3 استفاده شده است. جدول 3-3: لوازم، امکانات و تجهیزات آزمایشگاهی مورد استفاده در تحقیق نام دستگاه مشخصات دستگاه رنسیمت سوئیس Metrohm743- انکوباتور Memmert- آلمان اسپکتروفتومتر UV-2100 Unico آون Memmert- آلمان بن ماری فاطر ریز پرداز مدل 610- ایران ترازوی 0001/0 AND, GR200- ژاپن ترازوی 01/0 Sartorius, GE 1302- آلمان آسیاب Panasonic-solid state control japan juicer/blender حمام اولتراسونیک Eurosonic 4d from euronda co.(Vicenza.Italy 3-3- مراحل تحقیق و آزمون‌های مورد استفاده این رساله در 4 فاز یا مرحله جداگانه به شرح زیر انجام پذیرفت: 3-3-1- فاز اول: در این مرحله از تحقیق به شناسایی فاکتورهای موثر بر پاسخ پرداخته شد. 3-3-1-1- آماده سازی نمونه¬ها آماده سازی نمونه¬ها طبق بند 3-1-1 صورت گرفت. در هنگام شروع آزمایشات ابتدا به100 گرم از نمونه، پودر آب پنیر در مقدار مشخص (صفر، 10 و 20 گرم) بر اساس طرح آزمایشی افزوده شد و سپس میسلیوم¬های کپکی رشد یافته در محیط کشت MEA به مدت 10-7 روز به داخل ارلن مایرهای حاوی سوبسترا (پودر تفاله انگور+ پودر آب پنیر) با میزان محدود تلقیح گردید و به مدت 5 روز در دمای 30 درجه سانتی¬گراد گرماخانه گذاری شد. در این سیستم از مواد خشک(پودر تفاله انگور+ پودر آب پنیر) به عنوان سوبسترا استفاده ¬گردید و مقدار کمی آب برای تامین aw میکروارگانیسم مورد نیاز می¬باشد. 3-3-1-2 استخراج فرآیند استخراج بر اساس شرایط دمایی (45، 55 و 65 درجه سانتی¬گراد)، زمان (16، 24 و 32 دقیقه)، نوع حلال (اتانول و متانول) و غلظت حلال (40، 50 و 60%) مطابق با طرح آزمایش فاکتوریل ناقص (جدول3-4) در یک حمام اولتراسونیک Eurosonic 4d from euronda co.(Vicenza.Italy))) در معرض امواج فراصوت (فرکانس50 هرتز) انجام گرفت. سپس عصاره¬های استخراج شده با استفاده از کاغذ واتمن شماره 1 از مواد جامد جداسازی شده و تا زمان انجام آزمایشات در یخچال نگهداری شدند. جدول 3-4- طرح آزمایشات فاکتوریل ناقص به کار رفته برای استخراج در فاز اول Factor 5 Factor 4 Factor 3 Factor 2 Factor 1 Run E:S type D:Time C:Temp B:S C A:Wp Methanol 16 65 60 0 1 Ethanol 32 65 60 0 2 Ethanol 16 45 40 20 3 Methanol 16 45 40 20 4 Methanol 32 45 40 20 5 Methanol 32 45 40 20 6 Ethanol 16 45 60 20 7 Methanol 32 45 60 0 8 Methanol 16 45 60 0 9 Methanol 32 65 60 20 10 Ethanol 16 65 60 20 11 Ethanol 16 45 60 0 12 Methanol 16 45 60 20 13 Methanol 16 65 40 20 14 Ethanol 32 45 60 20 15 Ethanol 32 45 40 0 16 Ethanol 32 65 40 20 17 Ethanol 32 45 60 20 18 Methanol 16 65 60 0 19 Ethanol 16 65 40 0 20 Methanol 16 45 40 0 21 Ethanol 16 45 40 0 22 Ethanol 16 65 40 0 23 Methanol 16 65 40 20 24 Ethanol 24 55 50 10 25 Methanol 32 65 40 0 26 A:Whey protein powder(g /100 g)، B: Solvent concentration(%)، C: Temperature(˚C)، D:Time(min) ، T:Solvent type، M:Methanol، E:Ethanol 3-3-2- فاز دوم: در این مرحله از تحقیق به منظور یافتن شرایط بهینه فرآیند، آماده سازی نمونه و استخراج بر اساس طرح مرکب مرکزی انجام گرفت. 3-3-2-1- آماده سازی نمونه¬ها نمونه انگور مطابق روش ذکر شده در بخش 3-3-1-1 آماده¬سازی شد. در هنگام شروع آزمایشات ابتدا به100 گرم از نمونه تفاله پودر آب پنیر در مقدار مشخص (10، 20، 30، 40 و 50 گرم) بر اساس طرح آزمایش افزوده شد و سپس مطابق روش ذکر شده در بخش 3-3-1-1 تلقیح و گرماخانه گذاری شد. 3-3-2-2- استخراج فرایند استخراج بر اساس شرایط دمایی (55، 58، 61، 64 و 67 درجه سانتی¬گراد)، زمان (24، 26، 28، 30 و 32 دقیقه) و غلظت حلال (37، 40، 43، 46 و 49 %) مطابق با طرح آزمایش مرکب مرکزی (جدول3-5) در یک حمام اولتراسونیک مطابق روش ذکر شده در بخش 3-3-1-2 انجام شد. در این مرحله نوع حلال ثابت است و فقط از اتانول به عنوان حلال استفاده شده است. جدول 3-5- طرح آزمایشات به کار رفته برای استخراج در فاز دوم D:Time C:Temp B:S C A:Wp Run 28 61 43 30 1 28 61 37 30 2 28 61 43 30 3 30 58 40 20 4 28 61 43 30 5 30 58 40 40 6 28 55 43 30 7 26 64 40 40 8 26 64 46 40 9 30 58 46 40 10 26 58 46 40 11 30 64 40 40 12 26 64 46 20 13 28 61 49 30 14 32 61 43 30 15 26 58 40 40 16 28 61 43 30 17 28 61 43 30 18 26 64 40 20 19 26 58 46 20 20 28 61 43 30 21 30 64 46 40 22 26 58 40 20 23 30 58 46 20 24 30 64 46 20 25 28 67 43 30 26 30 64 40 20 27 28 61 43 50 28 24 61 43 30 29 28 61 43 10 30 A:Whey protein powder(g /100 g), B:Solvent concentration(%), C:Temperature(˚C)، D:Time(min) 3-3-3- فاز سوم: بهینه¬سازی شرایط بهینه مطابق جدول 3-6 می¬باشد. جدول 3-6 شرایط بهینه آزمایش Wp C Te Time 24.77 46 63.62 30 3-3-4- فاز چهارم: افزودن آنتی¬اکسیدان به روغن در این مرحله به منظور مقایسه تأثیر آنتی¬اکسیدان سنتزی TBHQ و آنتی¬اکسیدان طبیعی، آنتی¬اکسیدان سنتزی در 2 سطح (100 و 200 ppm) و عصاره استخراج شده در 3 سطح (200 و 400 و 600ppm) مطابق جدول 3-7 به نمونه روغن زرد افزوده شد و به نمونه شاهد هیچ آنتی اکسیدانی افزوده نشد. مقاومت اکسیداتیو کلیه نمونه¬ها توسط دستگاه رنسیمت اندازه گیری شد. جدول 3-7 مقادیر آنتی اکسیدانهای سنتزی و طبیعی افزوده شده به نمونه های روغن کره محلی آنتی اکسیدان بر حسبppm شماره نمونه 0 شاهد سنتزی 100 1 سنتزی 100 2 سنتزی 100 3 سنتزی 100 4 طبیعی 600 5 طبیعی 600 6 طبیعی 600 7 طبیعی 600 8 طبیعی 200 9 طبیعی 200 10 طبیعی 200 11 طبیعی 200 12 طبیعی 400 13 طبیعی 400 14 طبیعی 400 15 طبیعی 400 16 سنتزی 200 17 سنتزی 200 18 سنتزی 200 19 سنتزی 200 20 3-3-5- آزمایشات 3-3-5-1- اندازه گیری مقدار کل ترکیبات فنلی مقدار کل ترکیب¬های فنولی موجود در عصاره¬ها ازطریق رنگ سنجی به روش فولین – سیوکالتو (Folin- ciocalteu) اندازه¬گیری شد (.(McDonald et al., 2001 بعد از آماده سازی نمونه¬ها و مخلوط شدن با معرف، مقدار جذب محلول توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (UV-2100 Unico) درطول موج 765 نانومتر خوانده شد. برای تعیین محتوای فنل کل بر حسب میلی گرم در گرم نمونه از منحنی استاندارد اسید گالیک استفاده شد. 3-3-5-2- اندازه گیری مقدار کل ترکیبات فلاوونوئیدی برای تعیین مقدار کل ترکیبات فلاوونوئیدی از روش رنگ سنجی استفاده شد (Chang et al., 2002). جذب مخلوط آماده شده در طول موج 415 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتری خوانده شد. برای تعیین محتوای فلاوونوئید کل بر حسب میلی گرم در گرم نمونه از منحنی استاندارد کوئرسیتین استفاده شد. 3-3-5-3- قدرت مهار کنندگی رادیکال آزاد DPPH فعالیت ضداکسایشی ترکیبات فرار گیاهی با روش افزودن هیدروژن یا توانایی جمع آوری رادیکال، با استفاده از رادیکال پایدار DPPH انجام شد ( Hatano et. al., 1998). DPPH یک رادیکال آزاد پایدار است که در حضور آنتی اکسیدان¬ها در نمونه¬های بیولوژیک به صورت زیر خنثی می شود: DPPH + RH (DPPH – R)- H + R. رادیکال آزاد DPPH در محیط الکل اتانول باعث حداکثر جذب در 517 نانومتر و ایجاد یک رنگ ارغوانی می-گردد. در صورت خنثی شدن این رادیکال، از شدت رنگ ارغوانی کاسته شده و به زرد کم رنگ تغییر می یابد، بنابراین کاهش جذب نوری متناسب با توانایی خنثی سازی رادیکال DPPH و به عبارت دیگر قدرت آنتی اکسیدانی نمونه مورد نظر خواهد بود. نتایج به صورت درصد مهار یا خنثی سازی رادیکال DPPH توسط نمونه مورد نظر بیان می شود. 40 میکرولیتر از عصاره به لوله آزمایش منتقل شده و 1 میلی لیتر از محلول 2/0 میلی مولار DPPH به آن اضافه شد. کاهش جذب در 520 نانومتر بعد از 30 دقیقه برای نمونه¬ها خوانده شد. جذب رادیکال DPPH بدون عصاره بعنوان کنترل در نظر گرفته شد. درصد جمع آوری رادیکال مطابق فرمول ذیل محاسبه شد: DPPH = درصد مهار =(A_0-A_1)/A_0 ×100 3-3-5-4- فعالیت ضد اکسایشی کل به منظور ارزیابی فعالیت ضد اکسایشی کل عصاره¬ها از روش FRAP استفاده شد (Benzie and Strain,1996). 10 میکرولیتر از عصاره با 3 میلی لیتر از معرف FRAP مخلوط و جذب مخلوط حاصل در 595 نانومتر ارزیابی شد. غلظت¬های مشخصی (10 – 6/0 میکرومولار) از سولفات آهن (FeSO4) جهت منحنی کالیبراسیون مورد استفاده قرار گرفت. 3-3-5-5- تعیین پایداری اکسیداتیوی تعیین پایداری روغن¬ها و چربی¬ها در مقابل اکسیداسیون، به وسیله رنسیمت اندازه¬گیری شد که اولین بار توسط شرکت Metrohm و به وسیله پاردون و کرول در سال 1972 ارائه گردید. روش رنسیمت، بر اساس اندازه گیری محصولات حاصل از اکسیداسیون روغن¬ها و چربی¬ها است. زمان پایداری با استفاده از رنسیمت مدل Metrohm برای 10 گرم نمونه روغن و در دمای 110 درجه سانتی¬گراد اندازه گیری گردید. جریانی از هوا (h/1 20) از نمونه روغن مورد نظر که به دمای 110 درجه سانتی¬گراد رسیده بود، عبور داده شد. گازهایی که در طول فرایند اکسید شدن همراه با هوا آزاد می شوند از یک ظرف حاوی آب دی یونیزه عبور داده شد. الکترود موجود در این ظرف، برای اندازه گیری هدایت ویژه تعبیه شده است. پایان زمان پایداری هنگامی است که هدایت ویژه نسبت به زمان شروع، افزایش سریع پیدا می کند. زمان پایداری روغن بر حسب ساعت در 110 درجه سانتی¬گراد گزارش شد (تابعی و همکاران، 2008). شکل 3-1- منحنی تعیین زمان پایداری روغن 3-4- طرح آزمایشات و آنالیز آماری در مرحله اول ابتدا اثر چهار فاکتور عددی نظیر غلظت حلال در 3 سطح (40، 50 و 60 %)، پودر آب پنیر (0، 10 و 20 g/100g)، دما (45، 55 و 65 درجه سانتی¬گراد)، زمان (16، 24 و 32 دقیقه) و یک فاکتور اسمی یعنی نوع حلال (اتانول و متانول) با بکارگیری طرح فاکتوریل و درجه تمایز پنج مورد مطالعه قرار گرفتند. در مرحله دوم این مطالعه اثر غلظت حلال در 5 سطح (37، 40، 43، 46 و 49%)، پودر آب پنیر (10، 20، 30، 40 و 50g/100g)، دما (55، 58، 61، 64 و 67 درجه سانتی¬گراد)، زمان (24، 26، 28، 30 و 32 دقیقه) با بکارگیری روش سطح پاسخ، مدل درجه دوم به شاخص¬های مورد اندازه گیری برازش شد و نقاط بهینه با بکارگیری روش¬های عددی و یا گرافیکی تعیین گردیدند. در این مرحله از تحقیق از طرح مرکب مرکزی با 4 متغیر مستقل، 5 سطح و 6 تکرار در نقطه مرکزی طرح (به منظور بررسی تکرار پذیری طرح) استفاده گردید، تعداد کل تیمارها 30 تیمار شد (جدول 2). دما، زمان، غلظت حلال و میزان پودر آب پنیر متغیرهای مستقل و میزان ترکیبات پلی فنلی و فلاونوئیدها و قدرت مهارکنندگی رادیکال آزاد DPPH و فعالیت ضد اکسایشی کل (FRAP) متغیرهای وابسته بودند. معادله بدست آمده از طرح مرکب مرکزی با استفاده از معادله چند جمله ای درجه دو چنین بود: y ̂=β_0+∑_(i=1)^n▒β_i x_i+∑_(i=1)^n▒β_ii x_i^2+∑_(i=1)^n▒∑_(j>i)^n▒β_ij x_i x_j در این معادله y ̂ پاسخ پیش بینی شده، β0 ثابت مدل، βj ضریب خطی، Xi و Xj متغیرهای فاکتور در شکل کد شده، ijβ ضریب برهم کنش و jjβ ضریب درجه دوم می¬باشد. مناسب بودن مدل از روی داده¬های عدم برازش مدل، ضریب تبیین (R2 )، R2- adjusted و prediction R2 forو F-value حاصل از جدول آنالیز واریانس بررسی شد. معنی داری مدل و متغیرهای آن در سطح احتمال 01/0 p< تعیین شد. در مرحله سوم این مطالعه به منظور تأیید نتایج روش سطح پاسخ، عصاره در نقطه بهینه استخراج و تجزیه شد. در مرحله چهارم این مطالعه عصاره استخراجی در 3 سطح (ppm 200 ، 400 و 600) و آنتی اکسیدان سنتزی TBHQ در 2 سطح (ppm 100و 200) به نمونه روغن کره (روغن زرد) افزوده شدند و به وسیله رنسیمت پایداری روغن¬ها و چربی¬ها در مقابل اکسیداسیون اندازه گیری شد. فصل چهارم نتایج و بحث 4-1- نتایج مرحله اول در سری اول آزمایشات اثر 5 فاکتور میزان پودر آب پنیر (0،10 و 20 گرم به ازای 100 گرم نمونه)، دما (45، 55 و 65 درجه سانتی¬گراد)، زمان (16، 24 و 32 دقیقه)، نوع حلال (اتانول و متانول) و غلظت حلال (40، 50 و 60%) بر میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی و توان آنتی اکسیدانی عصاره های استخراج شده از پودر تفاله انگور تخمیر شده بررسی شد. نتایج آزمایشات مرحله اول به شرح جدول 4-1- می¬باشد. جدول 4-1- نتایج آزمایشات مرحله اول R4 R3 R2 R1 T D C B A Run 69.18 47.01 19.71 42.61 M 16 65 60 0 1 102.73 49.21 43.25 62.08 E 32 65 60 0 2 168.51 61.04 17.33 35.12 E 16 45 40 20 3 173.15 65.12 17.61 36.97 M 16 45 40 20 4 182.3 66.15 33.16 50.83 M 32 45 40 20 5 185.97 66.46 32.19 51.02 M 32 45 40 20 6 132.17 55.21 15.12 29.05 E 16 45 60 20 7 69.95 46.73 22.9 44.91 M 32 45 60 0 8 57.5 46.13 14.5 28.12 M 16 45 60 0 9 200.07 75.45 45.2 65.53 M 32 65 60 20 10 180.34 66.8 27.5 48.64 E 16 65 60 20 11 54.36 40.73 12.9 27.18 E 16 45 60 0 12 149.08 57.43 16.3 30.96 M 16 45 60 20 13 189.34 69.17 35.03 54.98 M 16 65 40 20 14 157.68 59.41 20.11 43.97 E 32 45 60 20 15 124.12 54.2 21.03 45.91 E 32 45 40 0 16 203.8 79.71 47.15 66.15 E 32 65 40 20 17 152.91 57.86 22.83 47.01 E 32 45 60 20 18 73.59 47.19 19.79 42.56 M 16 65 60 0 19 115.09 50.98 35.17 52.91 E 16 65 40 0 20 96.12 49.9 17.01 32.07 M 16 45 40 0 21 72.95 47.73 17.17 30.21 E 16 45 40 0 22 112.3 50.91 18.48 39.15 E 16 65 40 0 23 189.5 69.07 39.08 55.21 M 16 65 40 20 24 196 74.19 42.11 60.14 E 24 55 50 10 25 191.13 71.51 50.81 70.36 M 32 65 40 0 26 A:Wp (g /100 g)، B:Slv C(%)، C:Temp(˚C)، D:Time(min)، T:Solvent type، M:Methanol، E:Ethanol; R1: total phenol(mg/ g)، R2: flavonoieds(mg/ g)، R3: DPPH(%)، R4: FRAP(µmol/ g) 4-1-1- اثر فاکتورهای مختلف بر میزان ترکیبات فنلی کل بر اساس نتایج حاصل، مدل چند جمله ای درجه دو برای تمامی پاسخ¬ها از جمله میزان ترکیبات پلی فنلی برازش یافت. مدل چند جمله ای درجه دو ضریب رگرسیونی قابل قبولی را نشان داد. اگر ضریب رگرسیون بالای 80/0 باشد نشان دهنده مناسب بودن یک مدل و انطباق داده¬ها و خط محاسباتی حاصل از رگرسیون است. آنالیز داده¬ها نشان داد، می توان اثر فاکتورهای مختلف بر میزان ترکیبات فنلی کل در تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه را به مدل زیر نسبت داد : TP = -14.75 +(0.15*WP)-(0.27*Solv C)+(0.93*Tem) +(0,99*Time) WP: Whey protein powder (g/100g), SolvC: Solvent concentration (%), Temp: Temperature (°c)، Time: Time (min) R-Squared 0.98 Adj R-Squared 0.97 Pred R-Squared 0.97 نتایج آنالیز واریانس نشان داد که دما، زمان ، غلظت حلال و میزان پودر آب پنیر تاثیر معنی داری بر میزان استخراج ترکیبات فنلی داشتند (مطابق جدول 1 آنالیز واریانس صفحه 88). با افزایش دمای استخراج از ˚C 65- 45 میزان ترکیبات فنلی کل استخراج شده افزایش یافته است (شکل 4-1-). با افزایش زمان استخراج از 16 دقیقه تا 32 دقیقه میزان ترکیبات فنلی کل استخراج شده افزایش یافته است (شکل 4-2-). با افزایش میزان پودر آب پنیر از صفر تا 20 گرم به ازای 100 گرم نمونه میزان ترکیبات فنلی کل استخراج شده افزایش یافته است (شکل 4-3-). میزان ترکیبات فنلی کل استخراج شده با افزایش غلظت حلال از 40% تا 60% ، کاهش یافته است (شکل 4-4-). TP: total phenol Temp: Temperature(˚C) شکل 4-1 تأثیر دما بر میزان ترکیبات فنلی کل تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه TP: total phenol شکل 4-2 تاثیر زمان بر میزان ترکیبات فنلی کل تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه TP: total phenol WP:Whey protein powder شکل 4-3 تاثیر میزان پودر آب پنیر بر میزان ترکیبات فنلی کل تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه TP: total phenol SolvC: Solvent concentration(%) شکل 4-4 تاثیر میزان غلظت حلال بر میزان ترکیبات فنلی کل تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه 4-1-2- اثر فاکتورهای مختلف بر میزان ترکیبات فلاوونوئیدی محصولات جانبی به دست آمده از فراوری انگور مانند دانه ها یا تفاله، یک منبع ارزان و غنی از فلاوونوئیدها با خاصیت آنتی اکسیدانی محسوب می شوند که می توانند به عنوان مکمل غذایی مورد استفاده قرار گیرند (Gonzalez,2004). بر اساس نتایج حاصل، مدل چند جمله ای درجه دو برای پاسخ دوم یعنی میزان ترکیبات فلاوونوئیدی برازش یافت. آنالیز داده¬ها نشان داد، می توان اثر فاکتورهای مختلف بر میزان ترکیبات فلاوونوئیدی در تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه را به مدل زیر نسبت داد : Flavonoides = -19.64-)0.28*SolvC(+)0.77*Temp( +)0.86*Time( R-Squared 0.77 Adj R-Squared 0.74 Pred R-Squared 0.70 جدول آنالیز واریانس داده¬ها نشان داد که مدل فوق دارای ضریب تبیین0.77 = R2می¬باشد. از آنجایی که ضریب همبستگی کمتر از 8/0 می¬باشد، در نتیجه این مدل، برای پیش بینی میزان ترکیبات فلاوونوئیدی در تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه، چندان مناسب نمی باشد. با توجه به جدول آنالیز واریانس میزان پودر آب پنیر بر میزان ترکیبات فلاوونوئیدی تاثیر معناداری ندارد و دما، زمان و غلظت حلال بر میزان ترکیبات فلاوونوئیدی در تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه موثر بودند (مطابق جدول 2 آنالیز واریانس صفحه 89). همانطوریکه در اشکال 4-5 و 4-6 نشان داده شده است، میزان ترکیبات فلاوونوئیدی با افزایش دما و زمان استخراج افزایش یافته است. مطابق شکل 4-7- میزان ترکیبات فلاوونوئیدی با افزایش غلظت حلال از 40% تا 60% ، کاهش یافته است. Temp:Temperature شکل 4-5 تاثیر میزان دما بر میزان ترکیبات فلاوونوئیدی تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه شکل 4-6 تاثیر میزان زمان بر میزان ترکیبات فلاوونوئیدی تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه SolvC: Solvent concentration(%) شکل 4-7 تاثیر میزان غلظت حلال بر میزان ترکیبات فلاوونوئیدی تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه 4-1-3- اثر فاکتورهای مختلف بر قدرت مهار کنندگی رادیکال آزاد DPPH بر اساس نتایج حاصل، مدل چند جمله ای درجه دو برای پاسخ سوم یعنی میزان قدرت مهار کنندگی رادیکال آزاد DPPH برازش یافت. آنالیز داده¬ها نشان داد، می توان اثر فاکتورهای مختلف بر میزان قدرت مهار کنندگی رادیکال آزاد DPPH در تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه را به مدل زیر نسبت داد : DPPH = 36.38+)0.74*WP(-)0.34*SolvC( +)0.40*Temp( +)0.40*Time( R-Squared 0.88 Adj R-Squared 0.86 Pred R-Squared 0.81 مدل چند جمله ای درجه دو ضریب رگرسیونی قابل قبولی را نشان داد. اگر ضریب رگرسیون بالای 80/0 باشد نشان دهنده مناسب بودن یک مدل و انطباق داده ها و خط محاسباتی حاصل از رگرسیون است. نتایج آنالیز واریانس نشان داد که دما، زمان ، غلظت حلال و میزان پودر آب پنیر تاثیر معنی داری بر میزان قدرت مهار کنندگی رادیکال آزاد DPPH داشتند(مطابق جدول 3 آنالیز واریانس صفحه 90). همانطوریکه در اشکال 4-8- ، 4-9- و 4-10- نشان داده شده است میزان قدرت مهار کنندگی رادیکال آزاد DPPH با افزایش دما و زمان استخراج و همچنین میزان پودر آب پنیر افزایش یافته است. مطابق شکل 4-11- میزان قدرت مهار کنندگی رادیکال آزاد DPPH با افزایش غلظت حلال از 40% تا 60% ، کاهش یافته است. Temp:Temperature شکل 4-8 تاثیر میزان دما بر میزان قدرت مهار کنندگی رادیکال آزاد %DPPH تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه شکل 4-9 تاثیر میزان زمان بر میزان قدرت مهار کنندگی رادیکال آزاد DPPH% تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه SolvC: Solvent concentration(%) شکل 4-10 تاثیر میزان غلظت حلال بر میزان قدرت مهار کنندگی رادیکال آزاد DPPH تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه WP:Whey protein powder شکل 4-11تاثیر میزان پودر آب پنیر بر میزان قدرت مهار کنندگی رادیکال آزاد %DPPH تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه 4-1-4- اثر فاکتورهای مختلف بر فعالیت ضد اکسایشی کل بر اساس نتایج حاصل، مدل چند جمله ای درجه دو برای پاسخ چهارم یعنی میزان فعالیت ضد اکسایشی کل برازش یافت. آنالیز داده¬ها نشان داد، می توان اثر فاکتورهای مختلف بر میزان فعالیت ضد اکسایشی کل در تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه را به مدل زیر نسبت داد : FRAP = 66.30+(4.17*WP)-(1.46*SolvC) +(1.26*Temp) +(1.27*Time) R-Squared 0.97 Adj R-Squared 0.96 Pred R-Squared 0.95 مدل چند جمله ای درجه دو ضریب رگرسیونی قابل قبولی را نشان داد. اگر ضریب رگرسیون بالای 80/0 باشد نشان دهنده مناسب بودن یک مدل و انطباق داده ها و خط محاسباتی حاصل از رگرسیون است. نتایج آنالیز واریانس نشان داد که دما، زمان ، غلظت حلال و میزان پودر آب پنیر تاثیر معنی داری بر میزان فعالیت ضد اکسایشی کل داشتند(مطابق جدول4 آنالیز واریانس صفحه 91). همانطوریکه در اشکال 4-12- ، 4-13- و 4-14- نشان داده شده است میزان فعالیت ضد اکسایشی کل با افزایش دما و زمان استخراج و همچنین میزان پودر آب پنیر افزایش یافته است. مطابق شکل 4-15- میزان فعالیت ضد اکسایشی کل با افزایش غلظت حلال از 40% تا 60% ، کاهش یافته است. Temp:Temperature شکل 4-12 تاثیر میزان دما بر میزان فعالیت ضد اکسایشی کل تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه شکل 4-13 تاثیر میزان زمان بر میزان فعالیت ضد اکسایشی کل تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه WP:Whey protein powder شکل 4-14 تاثیر میزان پودر آب پنیر بر میزان فعالیت ضد اکسایشی کل تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه SolvC: Solvent concentration(%) شکل 4-15 تاثیر میزان غلظت حلال بر میزان فعالیت ضد اکسایشی کل تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه 4-2- نتایج مرحله دوم نتایج آزمایشات مرحله دوم به شرح جدول ذیل می¬باشد. جدول 4-2- نتایج آزمایشات مرحله دوم R4 R3 R2 R1 D C B A Run 62.21 53.4 53.12 158 28 61 43 30 1 18.04 10.5 18.19 85 28 61 37 30 2 61.18 52.12 54 164 28 61 43 30 3 25.47 19.87 38 139 30 58 40 20 4 60.04 50.89 50.5 157 28 61 43 30 5 24.76 18.7 36.5 134 30 58 40 40 6 20.1 18.04 50.19 155 28 55 43 30 7 38.5 30.85 24.12 95 26 64 40 40 8 76.9 64.8 60.33 172 26 64 46 40 9 30.95 24.8 81.51 203 30 58 46 40 10 28.28 21.29 78.09 198 26 58 46 40 11 39.28 30.9 26.1 99 30 64 40 40 12 80.95 68.83 65.14 175 26 64 46 20 13 70.95 57.53 87.51 197 28 61 49 30 14 65.23 55.58 60.93 165 32 61 43 30 15 22.14 15.19 34.06 124 26 58 40 40 16 55.91 46.49 53.5 155 28 61 43 30 17 58.17 50.1 49 166 28 61 43 30 18 35.92 28.91 30.18 114 26 64 40 20 19 29 22 83.8 202 26 58 46 20 20 59.18 47.6 48 165 28 61 43 30 21 86.42 71.28 65.95 178 30 64 46 40 22 24.69 16.62 35.41 131 26 58 40 20 23 33.8 26.88 87.9 203 30 58 46 20 24 90.23 71.81 70.03 185 30 64 46 20 25 72.61 60.77 28.5 107 28 67 43 30 26 41.42 32.59 32.19 120 30 64 40 20 27 47.14 38.7 44.98 144 28 61 43 50 28 43.8 35.19 50.21 154 24 61 43 30 29 50.23 41.29 53.18 157 28 61 43 10 30 A:Wp (g/100g)، B:Slv C(%v/v)، C:Temp) ˚C(D:Time) min) R1: total phenol(mg/g)، R2: flavonoieds(mg/g)، R3: DPPH،% R4: FRAP(µmol/g) 4-2-1- مقدار کل ترکیبات فنلی نتایج آنالیز واریانس نشان داد که دما، زمان و غلظت حلال هم به صورت خطی و هم به صورت درجه دوم تاثیر معنی داری بر میزان استخراج ترکیبات فنلی داشت (مطابق جدول 5 آنالیز واریانس صفحه 92). میزان پودر آب پنیر در شکل خطی اثر معنی دار نداشت ولی در شکل درجه دوم اثر آن معنی دار بود. اثر متقابل دما و غلظت حلال معنی دار است (p<0.01). با افزایش دما و غلظت حلال میزان ترکیبات فنلی افزایش یافته است (شکل 4-16). در زمان ثابت با افزایش غلظت حلال در محدوده 40 تا 46% میزان ترکیبات فنلی افزایش یافته است (شکل 4-17). بالاترین میزان استخراج ترکیبات فنلی (23/90 میلی گرم اسید گالیک در 100 گرم نمونه) در دمای 64 درجه سانتی¬گراد و مدت زمان 30 دقیقه و میزان پودر آب پنیر20 گرم و با غلظت حلال 46% بدست آمد. افزایش زمان استخراج مدت زمان انتقال جرم را افزایش داده و منجر به انتقال میزان بیشتری از ترکیبات موثره به داخل حلال می گردد. هررا و همکاران (2005) بیان داشتند که افزایش زمان استخراج به طور معنی داری بر روی میزان استخراج ترکیبات فنولیک از توت آسیاب شده و تفاله انگور موثر بود، که با نتایج این تحقیق مطابقت دارد. درمطالعات Revilla و همکاران (1998) تفاوت معنی داری (p<0. 01) با افزایش زمان استخراج در میزان ترکیبات فنلی از پوست انگور به دست آمد. Luciula و همکاران (2012) بیشترین میزان ترکیبات فنلی از مربای انگور قرمز را در دمای 60 درجه سانتی¬گراد، مدت زمان 25 دقیقه و با اتانول 50% استخراج کردند. افزایش دما تا حدود 70 درجه سانتی¬گراد سبب افزایش ضریب نفوذ حلال، نرم شدن بافت¬های گیاهی، ضعیف شدن دیواره سلول¬ها و هیدرولیز پیوندهای ترکیبات فنلی (فنل – پروتئین یا فنل – پلی ساکارید) می گردد (تبارکی و ناطقی، 2011). بایستی به این مساله توجه نمود که افزایش دما بیش از یک حد معین منجر به تجزیه تعدادی از ترکیبات فنلی می گردد. روستانگو و پالما (2007) تجزیه ایزوفلاونهای لوبیای سویا را در طی تیمار حرارتی گزارش نموده اند. مالونیل ایزوفلاونها در صورتیکه استخراج در محدوده دمایی 75 تا 100 درجه سانتی¬گراد صورت گیرد، تجزیه می شوند. استخراج بین 100 تا 125 درجه سانتی¬گراد استیل ایزوفلاونها را تحت تاثیر قرار می دهد و دماهای بالاتر به شدت باعث کاهش میزان گلوکوزیدها می¬شود (دیاه و همکاران، 2010). میزان قطبیت حلال مورد استفاده در استخراج به طور مستقیم علاوه بر میزان ترکیبات فنلی بر ترکیب و توان آنتی اکسیدانی آنها نیز تاثیر می گذارد (یو احمدنا و همکاران، 2005). تبارکی و ناطقی (2011) گزارش دادند به طور کلی قطبیت مخلوط آب – اتانول با افزودن آب به اتانول به تدریج افزایش می یابد. ترکیبات فنلی قطبی تر ممکن است مطابق اصل " مشابه، مشابه را حل می کند" استخراج شوند. بنابراین با اتانول 70% ترکیبات فنلی بیشتری نسبت به اتانول 90% استخراج می گردد. میزان استخراج ترکیبات فنلی کل با افزایش غلظت اتانول تا 67% افزایش یافت ولی افزایش بیشتر در غلظت اتانول منجر به کاهش میزان استخراج ترکیبات فنلی گردید. در مطالعات کاراکبی و همکاران (2010) در رابطه با بهینه سازی فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره ساقه انگور افزایش قابل توجه در فعالیت آنتی اکسیدانی با کاهش غلظت اتانول در محدوده 40% مشاهده گردید که با نتایج این تحقیق مطابقت دارد. Te: Temperature C: Solvent concentration(%) شکل 4-16 میزان ترکیبات پلی فنلی تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه به عنوان تابعی از غلظت حلال و دمای استخراج C: Solvent concentration(%) شکل 4-17 میزان ترکیبات پلی فنلی تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه به عنوان تابعی از غلظت حلال و زمان استخراج بر اساس نتایج حاصل، مدل چند جمله ای درجه دو برای تمامی پاسخ¬ها از جمله میزان ترکیبات پلی فنلی برازش یافت. مدل چند جمله ای درجه دو ضریب رگرسیونی قابل قبولی را نشان داد. معادله ذیل رابطه بین میزان ترکیبات فنلی را با میزان پودر آب پنیر، غلظت حلال، زمان و دما را نشان می دهد: Tp = 59.45-(0.85*WP)+(12.92*SolvC)+(16.99*Temp)+(9.65* SolvC * Temp)+(1.03* SolvC *Time)+(0.88* Temp*Time)-[2.77*( WP)2]-[3.82*( SolvC)2]-[5.37(Temp)2]-[3.003(Time)2] R-Squared 0.99 Adj R-Squared 0.99 Pred R-Squared 0.99 4-2-2- مقدار کل ترکیبات فلاوونوئیدی نتایج آنالیز واریانس نشان داد که همه متغیرها به استثناء میزان پودر آب پنیر هم به صورت خطی و هم به صورت درجه دوم تاثیر معنی داری بر میزان استخراج ترکیبات فلاونوئیدی داشتند. میزان پودر آب پنیر فقط به صورت درجه دوم تاثیر معنی داری بر میزان استخراج ترکیبات فلاونوئیدی داشت (مطابق جدول6 آنالیز واریانس صفحه 93). اثر متقابل دما و غلظت حلال معنی داراست p<0.01)). با افزایش دما و غلظت حلال میزان فلاوونوئیدها افزایش یافت (شکل 4-17). با افزایش میزان پودر آب پنیر تا 30 گرم میزان استخراج فلاوونوئیدها تا حدودی افزایش یافته ولی در مقادیر بالاتر از 30 گرم پودر آب پنیر، میزان استخراج فلاوونوئیدها سیر نزولی نشان داد (شکل 4-18). با افزایش زمان تا 28 دقیقه میزان استخراج فلاوونوئیدها افزایش یافته ولی در مقادیر بالاتر از 28 دقیقه، میزان استخراج فلاوونوئیدها سیر نزولی تدریجی را نشان داد (شکل 4-19). طبق گزارشات Juntachote و همکاران (2006) افزایش دما باعث افزایش نفوذ حلال به ماتریکس جامد و افزایش حلالیت ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی در حلال می گردد. افزایش پودر آب پنیر، افزایش ریزپپتیدها و ترکیبات نیتروژنی و سایر مواد مغذی را در پی دارد و با توجه به اینکه محدودیت ترکیبات نیتروژنی بعنوان عامل محدود کننده رشد کپک می تواند باشد و آن هم به نوبه خود روی ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی محلول اثر می گذارد و منجر به تولید کمتر ترکیبات فنلی قابل استخراج از واحد جرم سوبسترا می¬شود (کوریا و شتی،2003). رشد و تکثیر آسپرژیلوس اوریزه در این مطالعه یکی از مهمترین عوامل در تعیین میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی بوده است به طوریکه با افزایش رشد و افزایش متابولیت¬های حاصله منجر به افزایش ترکیبات فنلی آزاد و با قابلیت استخراج می¬شود که با نتایج آجیلا و همکاران(2010) مطابقت دارد. رابطه بین افزایش ترکیبات فنلی کل و فلاونوئیدها با افزایش رشد کپک¬ها و زیاد شدن جمعیت میکروبی همیشه حالت مستقیم خود را حفظ نمی کند که این مساله را می توان به خواص بازدارندگی ترکیبات فنلی نسبت داد چرا که این ترکیبات در غلظت¬های بالاتر از رشد و تکثیر میکروارگانیسم ها جلوگیری می کند (شتی و همکاران، 2003). مکانیسم اثر ترکیبات فنلی را در ارتباط با غیر فعال شدن آنزیم-های سلولی توسط این ترکیبات می دانند و یا اینکه این ترکیبات نفوذپذیری غشا سلولی را تحت تاثیر قرار می دهند. اثر بازدارندگی این ترکیبات را همچنین اثرگذاری بر اسیدهای نوکلئیک و اختلال در متابولیسم انرژی می دانند (شهیدی و ناکزک،2004). علت افزایش میزان استخراج ترکیب¬های فنولی و فلاونوئیدی با افزایش زمان اولتراسونیک را می توان به پدیده کاویتاسیون نسبت داد که در واقع در اثر انتشار امواج صوتی در فاز جامد - مایع، چرخه های انقباض و انبساطی در محیط ایجاد می شود که باعث تشکیل حباب¬هایی شده که این حباب¬ها در ادامه رشد و درنهایت متلاشی می شوند. این عمل باعث نوسان ذرات جامد و مایع شده و تحت عمل کاویتاسیون سرعت پیدا می کنند. درنتیجه مواد حل شونده سریعاً از فاز جامد به حلال انتشار پیدا می کنند . علاوه بر این، دیگر اثر¬ها مانند امولسیفیکاسیون، انتشار و صدمه به بافت نیز به افزایش استخراج اجزای مورد نظر از مواد خام کمک می کند . به طوری که در زمان¬های بالاتر ممکن است به دلیل وقوع اکسیداسیون به علت قرار گرفتن در معرض امواج اولتراسوند میزان استخراج کاهش یابد. ]]>