<br />

1-1- اهمیت گیاهان دارویی <br />علاقه به تولید گیاهان دارویی و تقاضا برای محصولات دارویی طبیعی بطور مداوم در جهان رو به افزایش می¬باشد، به طوری که داروسازان، قرن بیستم را قرن بازگشت به طبیعت و گیاهان دارویی نام نهاده¬اند. مطابق برآورد سازمان بهداشت جهانی (WHO) هشتاد درصد مردم دنیا برای مراقبت¬های بهداشتی اولیه بطور سنتی به گیاهان دارویی و تولیدات طبیعی تمایل دارند. گیاهان منبع بسیاری از داروهای جدید نیز می¬باشند. تخمین زده شده است که یک چهارم داروهای مورد استفاده، حاوی ترکیبات گیاهی یا ترکیبات فعال بدست آمده از گیاهان دارویی می¬باشند. مسکن¬های بسیار رایج نظیر کدئین و مرفین از گیاهان خانواده شقایق (Papaveraceae) منشأ گرفته¬اند. طبق گزارش سازمان ملل تولید جهانی مورفین برای کاربردهای دارویی سالانه 150 تن می باشد. از طرفی تخمین تولید مورفین برای سنتز هروئین (heroin) حداقل ده برابر بیشتر است. داروهای ضد سرطان رایج نظیر تاکسول و وین¬بلاستین تنها در منابع گیاهی یافت می¬شوند. مواد مؤثره گیاهان دارویی جزئی از متابولیت¬های ثانویه گیاهی به شمار می¬آیند که تولید آنها برای گونه¬های مولد ضروری نیست و در حقیقت حاصل فعالیت چرخه های بیوسنتزی فرعی هستند که از چرخه¬های بیوسنتزی اصلی (متابولیسم اولیه) مشتق می شوند و نقش اصلی آنها در سازگاری گیاه نسبت به محیط اطراف خود می¬باشد (Tripathi و همکاران 2003).
استفاده از روشهای کشت بافت و مهندسی ژنتیک امکان تولید گیاهانی با افزایش میزان تولید متابولیت-های ثانویه را فراهم می¬کند. تکنولوژی کشت بافت و سلول گیاهی در اواخر سال 1960 به عنوان یک ابزار در مطالعه و تولید متابولیتهای ثانویه گیاهی مورد استفاده قرار¬گرفت و راه حل¬های مختلفی با استفاده از سیستم¬های in vitro برای بهبود تولید ترکیبات ثانویه گیاهی به کار گرفته شد.
تاکنون از حدود 600000 گونه گیاهی جهان بیش از 30000 گونه بنا به ضرورت تجزیه گردیده و فقط قریب به 300 گونه از آنها به عنوان گیاه دارویی رسمی شناخته شده است. 60 گونه از این 300 گونه در عملیات به نژادی و به زراعی وارد شده و تنها معدودی از این 60 گونه به سطح تولید اقتصادی قابل توجه رسیده است. ارزش تجارت جهانی گیاهان دارویی بالغ بر 100 میلیارد دلار در سال برآورد شده است، که سهم ایران تنها 500 میلیون دلار است که بخش اعظم آن مربوط به زعفران و زیره می باشد و البته حداقل 10 میلیون دلار آن به صادرات مواد اولیه داروهای نارکوتیک (با منشا گیاه خشخاش) اختصاص می یابد به طوری که ایران «10درصد» از کل بازار مواد اولیه نارکوتیک «جهان» را در اختیار دارد. شرکت تولید مواد اولیه داروپخش (تماد) که یکی از تولید‌کننده‌های اصلی مواد اولیه نارکوتیک است، هم‌اینک به یکی از بزرگ‌ترین تولید‌کنندگان مواد اولیه دارویی در ایران و بزرگترین تولید‌کننده مواد اولیه دارویی مخدر (نارکوتیک) در خاورمیانه بدل شده است. این شرکت انواع محصولات نارکوتیک و غیرنارکوتیک خود را به ارزش متوسط حدود 10 میلیون دلار به اکثر کشورها نظیر: کانادا، انگلستان، آلمان، سوئیس، ژاپن، کره‌جنوبی، تایوان، هنگ‌کنگ، مالزی، تایلند، سنگاپور، روسیه، آفریقای جنوبی، اردن، عراق صادر می کند (مکاتبه شخصی با معاونت معتبرسازی شرکت تماد).
در کشور چین بازار سالیانه گیاهان دارویی از 8/1 میلیارد دلار در سال 1995 به حدود 8 میلیارد دلار در سال 1999 رسید. در حدود 10 میلیون نفر در این کشور در بخش گیاهان دارویی اشتغال دارند و سالانه 120 میلیون تن گیاه دارویی سالانه خرید و فروش می¬شود (Skipman و همکاران، 2002). ایران به دلیل دارا بودن تنوع آب و هوایی گسترده و ذخایر ژنتیکی گیاهی فراوان یکی از غنی¬ترین کشورها از نظر امکانات و استعدادهای طبیعی به شمار می¬رود. طبق گزارشات فلور ایران شامل 11000-8000 گونه گیاهی بوده که معادل دو برابر فلور کل اروپاست (نوروزیان، 1380).
استفاده از فراورده¬های طبیعی در پزشکی شاخه جدیدی از داروسازی را بوجود آورده است که به فارماکوگنسی (Pharmacognosy) معروف است و بسیاری از شرکت های دارویی به تحقیق در زمینه اثر عصاره¬های گیاهی در درمان بیماری¬ها می¬پردازند. ترکیباتی نظیر کدئین و مرفین و مشتقات آنها جزء آلکالوئیدهای ایزوکوئینولینی به عنوان مسکن، هیوسیامین و اسکوپولامین¬ها در درمان بیماری¬های قلبی و حرکتی کورارین Qurarine)) به عنوان سست کننده قوی در جراحی¬ها، وین¬کریستین و وین¬بلاستین در درمان سرطان خون و تاکسول دارای اثرات ضد سرطان کاربرد گسترده¬ای در پزشکی دارند (Lee و همکاران، 1999). Aneja و همکاران (2007) نشان دادند که آلکالوئید نوسکاپین (ضد سرطان) موجود در خشخاش به عنوان یک عامل متصل شونده به توبولین است که سبب متوقف شدن حرکت میکروتوبول¬ها شده و سلول¬های پستانداران را در مرحله میتوز متوقف می کند. تیمار نوسکاپین موجب افزایش بیان P53 در سلول¬های نرمال می شود. این افزایش ناشی از افزایش BAX/BCL2به همراه افزایش حساسیت این سلول¬ ها به القای مرگ سلولی است.
از آنجا که افزایش سریع در عملکرد مرفین از طریق اصلاح سنتی تقریبا” محدود شده است، تراریختی ژنتیکی گیاه خشخاش فرصت مناسبی را جهت افزایش و بهبود مواد آلکالوئیدی در اندامهای مختلف گیاه خشخاش فراهم می¬کند (Facchini وهمکاران، 2005). با این حال به دلیل محدودیت های بین المللی در کشت خشخاش و نیز انحصاری بودن مجوز کشت خشخاش توسط سازمان ملل، استفاده از تکنیک های کشت درون شیشه ای و تولید انبوه در بیوراکتورهای گیاهی می تواند مورد توجه قرار گیرد.
داشتن مجموعه ای از ژنهای موثر در مسیر بیوسنتز آلکالوئیدهای بنزوایزوکواینولینی به همراه پروتکلی برای تولید ریشه مویی تراریخت با سرعت رشد بالا، یک سیستم مدل قدرتمند برای یافتن مکانیزم های تنظیم مولکولی بیوسنتز این آلکالوئیدها را فراهم می سازد و مهندسی متابولیکی در این گیاه دارویی مهم را ممکن می سازد. برای رسیدن به این هدف، به دلیل پدیده از بین رفتن ریزنمونه¬ها و سختی تراریختی گیاه P. somniferum در شیشه، گیاه P. bracteatum با دارابودن آلکالوئیدهای مورفینان می تواند به عنوان منبعی برای تامین مواد اولیه داروهای نارکوتیک در شیشه مورد توجه قرار گیرد. از آنجا که این گیاه محتوی تبائین بسیار بالا و مورفین پائینی دارد، می تواند در جهت تولید بالاتر مورفین مورد دستکاری قرار گیرد. در این تحقیق سعی بر این قرار گرفت تا یک روش موثر برای القای ریشه مویی تراریخت از این گیاه که دارای ژنهای نوترکیب در مسیر ساخت آلکالوئیدهای مورفینان ارائه شود. در این مسیر ابتدا سازه های حاوی ژن های SalAT و CodR از طریق تراریختی موقت مورد آزمون قرار گرفت و سپس روش تراریختی جهت تولید ریشه مویی با استفاده از نژادهای مختلف A. rhizogenes و محیط¬های هم کشتی حاوی نمک¬های معدنی متفاوت بررسی گردید. در ادامه محیط رشد مناسب برای ریشه مویی بدست آمد. در این مرحله تراریختی دائم از طریق القای ریشه مویی تراریخت حاوی ژن¬های SalAT و CodR صورت گرفت و بیان ژن¬های فوق و میزان آلکالوئیدهای مورفینان بررسی گردید.

مطلب مرتبط :   گرگان، شهری، کاربریهای، ، مشاور، تحولات

1-2- متابولیت های ثانویه
مسیرهای متابولیکی فراوانی در گیاهان وجود دارد که حاصل فعالیت آنها تأمین ترکیبات حیاتی برای گیاه است. این مسیرهای متابولیکی حیاتی را متابولیسم اولیه و فراورده¬های حیاتی حاصل از آنها را که به طور مستقیم در رشد و متابولیسم دخالت دارند متابولیت¬های اولیه گویند. مسیرهای سنتز کربوهیدرات ها، لیپیدها، پروتئین¬ها و اسیدهای نوکلئیک در گیاهان از جمله مسیرهای متابولیکی اولیه می¬باشند. جنبه دیگری از متابولیسم که می¬توان آن را وجه تمایز گیاهان و جانوران دانست این است که گیاهان و قارچ-ها مسیرهای متابولیکی متنوعی دارند که از مسیرهای متابولیکی اولیه مشتق می¬شوند و برای بقاء موجود نیز حیاتی نیستند این مسیرهای پیرامونی را مجموعا” متابولیسم ثانویه و فراورده¬های آنها را متابولیت¬های ثانویه می¬نامند. بسیاری از ترکیبات ارزشمند بیوشیمیایی محصول متابولیسم ثانویه گیاهی می¬باشد. گیاهان طیف وسیعی از متابولیت های ثانوی را تولید می کنند که اغلب بر اساس ویژگی های شیمیایی طبقه بندی می شوند. سه گروه از متابولیت های ثانویه عبارتند از: ترپنوئیدها ، آلکالوئیدها و ترکیبات فنلی (Lee و همکاران، 1999).
الف) ترپنوئیدها: بزرگترین طبقه متابولیت های ثانویه بدون شک ترپنوئید¬ها می باشد که بالغ بر 27000 نوع از اعضای این گروه گزارش شده است. ترپنوئید¬ها به طور وسیعی در ساختار، متنوع می باشند که ناشی از هزاران اسکلت کربنی متفاوت و تجمع وسیعی از گروه های عاملی است. با وجود چنین تنوعی تمامی ترپنوئید¬ها دارای یک روش سنتزی متعارف منحصر به فرد می باشند: اتصال واحدهای 5 کربنی (C5) با ساختار ایزوپنتونوئید.
ب) آلکالوئیدها: این ترکیبات شامل دسته ای از محصولات طبیعی حاوی نیتروژن می باشند که به دلیل ویژگی های دارویی به خوبی شناخته شده اند، لذا بسیاری از داروهای متعارف اساس آلکالوئیدی دارند. مثال معمول آن شامل نیکوتین ، کدئین و مورفین می باشد. این مواد به جای اینکه به طور سنتزی تولید شوند اغلب از منابع گیاهی مشتق می شوند (Wink وهمکاران 1999).
ج) ترکیبات فنلی: اصطلاح ترکیبات فنلی در واقع طیف وسیعی از موادی را شامل می شود که حاوی حلقه آروماتیک با گروه عاملی هیدروکسیلی می باشند و نیز تعداد زیادی از این ترکیبات در منابع گیاهی و حیوانی وجود دارد. در واقع حضور بخش فنلی ویژگی تمام بافت های گیاهی است. در میان ترکیبات پلی فنلی گیاهی، فلاونوئید¬ها بزرگترین گروه می باشند(Lee و همکاران، 1999).

مطلب مرتبط :   سیاست، جنایی، حقوق، حکمرانی، کیفری، گفتمان

1-3- بیورآکتورها و کاربرد آنها
بیوراکتورها مرحله کلیدی در تولید اقتصادی و تجاری متابولیتهای ثانویه توسط زیست¬فن¬آوری گیاهی می¬باشد. از سیستم بیورآکتور تاکنون در کشتهای اندام¬زایی و جنین¬زایی چندین گونه استفاده شده است (Levin و همکاران، 1988). مقادیر بالای سانگواینارین(Sangoinarine) در کشت¬های سوسپانسیون سلولی Papaver somniferum با استفاده از بیورآکتور تولید گردید (Park و همکاران، 1992). در کشتهای بافت ریشه گیاه Ginseng در یک بیورآکتور 20 تنی در حدود mg/l/day500 تولید ساپونین گزارش شده است (Charlwood و همکاران، 1991). پیشرفتهای چشمگیری در ارتباط با بهینه¬سازی سیستم¬های کشت بیورآکتورها جهت تولید و استخراج ترکیبات با ارزش گیاهان دارویی نظیر شیکونین بدست آمده است. ریشه¬های کشت شده در گیاه سرخدار(Taxus) در بیوراکتورها موجب آزادشدن ترکیبات فعال دارویی ضد سرطان به داخل محیط مایع بیوراکتورها آزاد می¬شود که به صورت پیوسته آن را می¬توان جهت تهیه دارو استخراج نمود (March و همکاران، 2000).

1-4- کاربرد فناوری های نوین در افزایش تولید متابولیت¬های ثانویه
تصور براین است که استفاده از روش کشت سلول گیاهی برای ترکیبات مهم دارویی زمانی به صورت صنعتی قابل استفاده خواهد شد که یا میزان تولید متابولیت¬ها افزایش یابد، یا ترکیبات جدید در سلول-های گیاهی تولید شود و یا بیش از یک ترکیب مطلوب در گیاه، قابل تولید باشد. این حالت توسط انتخاب رده¬های سلولی گیاهی خاص، یا استفاده از سایر عوامل محیط رشد یا تولید بدست نمی¬آید. بنابراین نیاز به مطالعه مسیرهای متابولیکی و مراحل تنظیمی جهت بیان فوق¬العاده ژنهای تنظیمی برای مراحل محدود کننده در مسیر ساخت محصول مورد نظر، لازم می¬باشد. پیشرفت¬های اخیر در تکنیک های کشت سلول و بافت گیاهی و نیز تراریختی ژنتیکی گیاهان با استفاده از روش¬های مبتنی بر آگروباکتریوم و روش انتقال مستقیم ژن، امکان الحاق ژن¬های خارجی به داخل گیاهان جهت تولید صفات مورد نظر با ژنوتیپ جدید را فراهم آورده است. برای دستورزی ژنها شناخت مسیر زنجیره تولید و دسترسی به ژنهای ضروری می¬باشد که در اغلب موارد اطلاعاتی در مورد آنها وجود ندارد. مهندسی متابولیت ثانویه در چند سال اخیر به عنوان روش مناسب به کارگرفته شده است (Verport و همکاران، 2002). کلون ژن¬های مختلف و استفاده از روش¬های انتقال ژن، استفاده از مهندسی متابولیت را به عنوان روش احتمالی افزایش عملکرد متابولیت¬های ثانویه فراهم کرده است. مهندسی متابولیت با استفاده از چندین استراتژی باعث بهبود عملکرد می¬گردد. 1- همه جریان کربن به سمت محصول مطلوب باید افزایش یابد و این از طریق غلبه بر مراحل محدود¬کننده و یا بلوکه¬کردن مسیرهای رقابتی امکان¬پذیر است. 2- بلوکه¬کردن کاتابولیسم. کاتابولیسم یک فاکتور مهم در تولید و تجزیه متابولیت¬های اولیه و همچنین ثانویه می¬باشد، برای مثال در گیاهان توتون، نیمه عمر نیکوتین 22 ساعت می¬باشد (Valler و همکاران، 1978). در کشت سلولی پروانش نشان داده شده که میزان رشد بیوسنتز آجمالیسین مشابه مقدار کاتابولیسم آن می¬باشد (Samtan و همکاران، 1999). کاتابولیسم در مسیرهای رقابتی توسط ژن-های آنتی¬سنس می¬تواند بلوکه گردد. جهت افزایش فعالیت آنزیم، توالی سنس ژن مورد نیاز است که این می¬تواند یک ژن از همان گیاه یا از گونه¬های گیاهی دیگر یا از ارگانیسم¬های دیگر نظیر ژن¬های میکروارگانیسم گرفته شده باشد. انجام مهندسی متابولیک نیازمند اطلاعاتی درباره مسیرهای