3- مواد وروشها

3-1- مکان و زمان انجام پژوهش
این پژوهش در گلخانه و آزمایشگاههای پژوهشی گروههای علوم باغبانی، خاکشناسی و صنایع غذایی دانشکده کشاورزی و همچنین گروه زیست شناسی دانشکده علوم دانشگاه ارومیه طی سال های 1389 و 1390 به اجرا درآمد.

3-2- روش انجام پژوهش
به منظور بررسی تاثیر دو ماده اسید سالیسیلیک و سدیم نیترو پروسید (به عنوان ماده آزاد کننده نیتریک اکسید) بر ویژگیهای مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی دو رقم انگور (قرهشانی و تامپسونسیدلس) در شرایط تنش شوری، پژوهشی گلدانی بهصورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی با چهار تکرار اجرا گردید. این پژوهش در قالب دو آزمایش جداگانه انجام گرفت. در آزمایش اول قلمههای ریشهدار شده هر دو رقم با 5 سطح شوری (شوری در محلول غذایی) 0 (شاهد)، 25، 50، 75 و 100 میلی مولار کلرید سدیم و 4 سطح اسید سالیسیلیک (محلولپاشی برگسارهای) 0(شاهد)، 100، 200 و 300 میلیگرم در لیتر تیمار گردیدند.
در آزمایش دوم قلمههای ریشهدار شده هر دو رقم با همان سطوح شوری مشابه آزمایش اول و چهار سطح سدیمنیتروپروسید (محلول پاشی برگسارهای)، 0 (شاهد)، 5/0 ،1و 5/1 میلی مولار تیمار شدند.
در این پژوهش، فاکتورهای مورد نظر شامل:
الف- دو رقم انگور (قره شانی و تامپسون سیدلس)
ب- 5 سطح شوری (0، 25، 50، 75 و 100 میلی مولار)
ج- غلظتهای مختلف اسید سالیسیلیک در 4 سطح (0، 100، 200 و 300 میلی گرم در لیتر) و سدیم نیترو پروسید در 4 سطح (0، 5/0، 1 و 5/1 میلی مولار)

3-3- مواد گیاهی و شرایط رشد
در این پژوهش، از قلمههای شناسنامهدار دو رقم انگور (قرهشانی و تامپسون سیدلس) استفاده گردید. این رقمها از کلکسیون انگور مرکز تحقیقات جهاد کشاورزی استان آذربایجان غربی تهیه شدند.
ابتدا قلمه های چوب سخت انگور دارای دو میانگره، تهیه و با محلول قارچکش بنومیل (به نسبت 5/2 گرم قارچ کش در 1 لیتر آب) به مدت 5 دقیقه ضدعفونی و سپس چند دقیقه در هوای آزاد قرار گرفته تا خشک شدند. سپس این قلمهها در گلخانه در محیط کشت پرلیت به فاصله 3 سانتیمتر از یکدیگر بهصورت ردیفی کاشته شدند. بعد از گذشت 5/3 ماه از کاشت قلمهها، قلمههای ریشه دار شده یکدست و هم اندازه، به گلدانهای پلاستیکی با قطر دهانه 25 و ارتفاع 26 سانتی متر محتوی محیط کشت پرلیت و کوکوپیت (به نسبت حجمی 1:1) انتقال و تحت شرایط سیستم هیدروپونیک قرار گرفتند. هر گلدان محتوی یک قلمه ریشه دار شده بود. گیاهان در گلخانهای با شرایط نور طبیعی و دمای 3± 19/27 (شب/روز) درجه سلسیوس و رطوبت نسبی 10±50 درصد مستقر شدند.

3-4- ترکیب محلول غذایی

محلول غذایی هوگلند شامل 5/2 میلیمولار Ca(NO3)2، 1 میلیمولار MgSO4، 5/2 میلیمولار KNO3، 5/0 میلیمولار KH2PO4، 23 میکرومولار H3BO3، 6 میکرومولار MnSO4، 7/0 میکرومولار ZnSO4، 3/0 میکرومولار CuSO4، 1/0 میکرومولار H2MoO4 و 32 میکرو مولار Fe-EDTA بوده و pH محلول غذایی 3/6 بود. از شروع کاشت قلمههای ریشه دار شده در گلدانها، گیاهان، هفتهای سه بار، ابتدا با 150 میلیلیتر و در ادامه همزمان با افزایش رشد گیاهان با 200 میلیلیتر محلول غذایی هوگلند تغییر یافته (نیم غلظت) آبیاری شدند (Hoagland and Arnon, 1950).

3-5- نحوه اعمال تنش شوری
قلمههای ریشهدار شده انگور، بعد از استقرار در گلدان، با محلول غذایی هوگلند آبیاری شده و پس از گذشت 100 روز از کاشت قلمههای ریشهدار شده در گلدانها، تیمارهای شوری، اعمال شد. نمک مورد استفاده برای تنش شوری، کلرید سدیم بود. این نمک همراه با محلول غذایی هوگلند، مورد استفاده قرار گرفت. غلظتهای کلرید سدیم مورد استفاده شامل 0 (شاهد)، 25، 50، 75 و 100 میلیمولار بودند. گیاهان شاهد، فقط محلول غذایی نیم غلظت هوگلند (بدون نمک) دریافت نمودند. هدایت الکتریکی (EC) نمکهای مورد استفاده در دمای 25 درجه سلسیوس، به ترتیب 4/1، 6/3، 5/7 و 8/11 دسیزیمنس بر متر بود.
برای جلوگیری از ایجاد شوک ناشی از تنش شوری به گیاهان، در اولین آبیاری بعد از شروع تنش شوری، از نمک 25 میلی مولار همراه با محلول غذایی هوگلند استفاده شد، در آبیاری دوم از نمکهای 25 و 50 میلی مولار، در آبیاری سوم از نمکهای 25، 50 و 75 میلی مولار و نهایتا از آبیاری چهارم به بعد، از نمک های 25، 50، 75 و 100 میلی مولار در محلول غذایی استفاده شد. هفته ای یک بار، شتشوی کامل محیط ریشه گیاهان با آب مقطر انجام گرفت تا تغییرات EC و pH ناشی از تجمع نمکها در بستر کاشت در اثر انجام عمل آبشویی به کم ترین حد ممکن برسد. آبیاری این گیاهان به صورت یک روز در میان با محلول نیم غلظت هوگلند تا پایان دوره آزمایش انجام شد. لازم به ذکر است که تیمارهای شوری به مدت هفت هفته (49 روز) ادامه یافت (Sivritepe et al., 2010 ; Melgar et al., 2008).

3-6- کاربرد سدیم نیتروپروسید (SNP)
سدیم نیترو پروسید (SNP) به عنوان ماده تولید کننده نیتریک اکسید، به صورت محلول پاشی روی برگهای انگور، در چهار غلظت 0 (شاهد)، 5/0، 1 و 5/1 میلی مولار به کار رفت. نحوه تهیه محلول سدیم نیترو پروسید به این ترتیب بود که مقادیر نامبرده این ماده را جداگانه وزن نموده، سپس آنها را در آب مقطر ریخته و برای حل شدن بهتر، روی دستگاه Hot Plate به مدت بیست دقیقه قرار میدهیم. گیاهان شاهد فقط با آب دیونیزه، محلول پاشی شده و محلول غذایی هوگلند بدون نمک دریافت نمودند. برای افزایش سطح چسبندگی محلول سدیم نیترو پروسید، از توین 20 استفاده شد. تیمارهای سدیم نیترو پروسید، در 4 مرحله (در زمان تیمار شوری و مراحل بعدی، 2، 4 و 6 هفته بعد) روی برگ ها محلول پاشی شدند.

3-7- کاربرد اسید سالیسیلیک
اسید سالیسیلیک نیز به صورت محلولپاشی روی برگهای انگور، در چهار غلظت 0 (شاهد)، 100، 200 و 300 میلی گرم در لیتر اعمال گردید. نحوه تهیه محلول اسید سالیسیلیک به این ترتیب بود که مقادیر نامبرده این ماده را جداگانه وزن نموده، سپس آنها را در آب مقطر ریخته و برای حل نمودن بهتر، روی دستگاه Hot Plate به مدت نیم ساعت قرار می دهیم. نکته مهم در تهیه این محلول، تنظیمpH است ( در ابتدا pH محلول بین 5/2 تا 3 است). با اضافه نمودن چند قطره هیدروکسید پتاسیم یک نرمال، pH محلول را برروی 6 تنظیم می نماییم. گیاهان شاهد، فقط با آب دیونیزه محلولپاشی شده و محلول غذایی هوگلند بدون نمک دریافت نمودند. تیمارهای اسید سالیسیلیک نیز در 4 مرحله (در زمان شروع تیمار شوری و مراحل بعدی 2، 4 و 6 هفته بعد) روی برگها محلول پاشی شدند.

3-8- صفات مورد بررسی و روشهای اندازهگیری آنها
3-8-1- ویژگیهای رشدی گیاه
به منظور بررسی اثر تنش شوری بر برخی از ویژگیهای رویشی گیاهان مورد آزمایش، در پایان آزمایش، صفاتی نظیر ارتفاع بوته و طول ریشه توسط خط کش، قطر ساقه (قطر شاخساره حاصل از رشد) توسط کولیس دیجیتال (No:Z, Model 22855)، سطح برگ توسط دستگاه اندازه گیری سطح برگ (Leaf Area Meter, AM 200) و وزن تر برگ، وزن تر شاخساره و ریشه به کمک ترازوی دیجیتالی (با دقت 0001/0 گرم) اندازه گیری گردید. همچنین تعداد برگها شمارش شد. جهت تعیین وزن خشک نمونهها (برگ، شاخساره و ریشه)، ابتدا نمونهها به مدت 72 ساعت در آون با دمای 70 درجه سلسیوس قرار گرفتند و پس از خارج نمودن نمونهها از آون، وزن خشک آن ها به کمک ترازوی دیجیتالی (با دقت 0001/0 گرم) تعیین شدند.

3-8-2- اندازه گیری نشت یونی غشاء برگ
روش کار بدین صورت بود که از هر تکرار، تعداد دو برگ توسعه یافته از قسمت انتهایی ساقه، نمونه گیری و به قطعههای 1×1 سانتی متر تقسیم شدند. قطعهها 3 بار با آب مقطر شسته شده و در لولههای آزمایش 10 میلی لیتری محتوی آب مقطر نگهداری شده، سپس به مدت 24 ساعت در دمای اتاق (25 درجه سلسیوس)، در دستگاه شیکر قرار گرفته و EC1 خوانده شد. سپس همان نمونهها در اتوکلاو در دمای 120 درجه سلسیوس به مدت 20 دقیقه قرار گرفته و بعد از خنک شدن محلول و رسیدن دمای آنها به 25 درجه سلسیوس، EC2 نیز قرائت شد. نشت یونی غشاء برگ به صورت درصد با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد (Luttes et al., 1995).
[EC1/EC2]×100 = نشت یونی غشاء برگ (٪)

3-8-3- محتوای نسبی آب برگ(RWC)
برای اندازه گیری محتوای نسبی آب برگ، ابتدا در هر بوته، 10 عدد دیسک برگی به قطر 8 میلی متر از برگهای توسعه یافته قسمت انتهایی ساقه تهیه شد. بلافاصله وزن تر آنها به کمک ترازوی دیجیتالی (با دقت 0001/0 گرم) اندازهگیری گردید و سپس در داخل ظروف پتری دیش حاوی آب مقطر به مدت 4 ساعت در یخچال (4 درجه سلسیوس) و در تاریکی قرار داده شدند. پس از خارج کردن دیسکها از آب مقطر، جهت حذف رطوبت اضافی سطح دیسک ها، آنها را در بین دو لایه کاغذ صافی خشک نموده و سپس وزن آماس آنها اندازه گیری شد، سپس به مدت 24 ساعت دیسک های برگی را به آون (70 درجه سلسیوس) منتقل نموده و وزن خشک آنها تعیین گردید و در نهایت محتوای نسبی آب برگ با استفاده از رابطه زیر محاسبه شد (Turner, 1981).
100×[(وزن خشک-وزن آماس)/(وزن خشک-وزن تر)]=محتوای نسبی آب برگ (درصد)

3-8-4- میزان پرولین آزاد
برای اندازهگیری پرولین ابتدا نیم گرم از بافت تازه برگی (برگهای توسعه یافته انتهایی) به همراه 5 میلی لیتر اتانول 95 درصد در داخل هاون چینی کوبیده و له شد. قسمت بالایی محلول حاصله، جدا گشته و رسوبات آن دوباره با پنج میلی لیتر اتانول 70 درصد شستشو شده و فاز بالایی آن به قسمت رویی قبلی اضافه گردید. محلول بهدست آمده، به مدت 10 دقیقه در 3500 دور سانتریفیوژ شد. سپس فاز مایع رویی برداشته شده و عصاره الکلی به دست آمده تا زمان اندازهگیری پرولین و قندهای محلول در داخل یخچال (4 درجه سلسیوس) نگهداری گردید (Irigoyen et al., 1992).
برای تعیین غلظت پرولین، یک میلی لیتر از عصاره الکلی تهیه شده را با 10 میلی لیتر آب مقطر رقیق نموده و 5 میلی لیتر معرف نین هیدرین19به آن اضافه شد (روش تهیه نین هیدرین به ازاء هر نمونه: 125/0 گرم نین هیدرین + 2 میلی لیتر اسید فسفریک 6 مولار + 3 میلی لیتر اسید استیک گلاسیال). پس از افزودن 5 میلی لیتر اسید استیک گلاسیال به آن و هم زدن دستی به مدت چند ثانیه، محلول حاصله به مدت 45 دقیقه در حمام آب گرم (100 درجه سلسیوس) قرار داده شد. پس از در آوردن نمونه ها از حمام آب گرم و خنک شدن آن ها، 10 میلی لیتر بنزن به هر کدام از نمونه ها افزوده شده و به شدت تکان داده شد تا پرولین وارد فاز بنزن گردد. نمونهها به مدت 30 دقیقه به حال سکون رها شدند. استانداردهایی از آلپرولین از غلظت صفر تا 1/0 میکرومول بر میلی لیتر تهیه گردید و نهایتا میزان جذب محلول های استاندارد و نمونه ها در طول موج 515 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد (Paquin and Lechasseur, 1979).

3-8-5- میزان قندهای محلول کل
برای اندازهگیری قندهای محلول، 1/0 میلی لیتر از عصاره الکلی نگهداری شده در یخچال، به کمک میکروپیپت به داخل لوله آزمایش ریخته شده و 3 میلی لیتر آنترون20 تازه تهیه شده (150 میلی گرم آنترون + 100 میلی لیتر اسید سولفوریک 72 درصد، W/W) به آن افزوده شد. لولههای آزمایش به مدت 10 دقیقه در حمام آب جوش قرار داده شد تا ماده رنگی تشکیل گردد. پس از خنک شدن نمونهها، میزان جذب آنها در طول موج 625 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. برای تهیه استاندارد قند، از گلوکز، محلولهایی با غلظت های صفر تا 120میلی گرم در لیتر تهیه و کلیه مراحل آزمایش روی آنها انجام گردید و نهایتا میزان جذب آنها در طول موج 625 نانومتر قرائت گردید (Irigoyen et al., 1992).

3-8-6- اندازهگیری محتوای مالون دی آلدئید (MDA)
اندازهگیری محتوای مالوندیآلدئید که شاخص پراکسیداسیون لیپیدی در طی تنشها و همچنین معیاری برای سنجش تاثیر تنش میباشد، با استفاده از روش Popham and Novachy (1991) اندازهگیری شد. در این روش 2/0 گرم بافت تر گیاهی (برگ) در 5 میلی لیتر تری کلرو استیک اسید (TCA) 1 درصد ساییده شده و داخل لوله آزمایش ریخته شد. سپس نمونه ها به مدت 10 دقیقه در دور g 8000 سانتریفیوژ شدند. 1 میلی لیتر از فاز بالایی نمونههای سانتریفیوژ شده، در لولههای آزمایش که حاوی 4 میلی لیتر محلول 20 درصد تری کلرو استیک اسید در 5/0 درصد تیوباربیتوریک اسید (TBA) بودند، ریخته شد. نمونهها به مدت 30 دقیقه در بن ماری با دمای 95 درجه سلسیوس قرار گرفته و بی درنگ در آب یخ سرد شدند. سپس به مدت 5 دقیقه در دور g 8000 سانتریفیوژ شده و در نهایت جذب آن در 532 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه گیری شد. میزان مالون دیآلدئید با استفاده از فرمول زیر محاسبه گردید.
MDA (µmol/g FW)= [A532-A600/155]×1000

3-8-7- اندازهگیری رنگیزههای کلروفیل و کاروتنوئید
برای اندازهگیری رنگیزههای کلروفیل و کاروتنوئید، از روش Lichtenthaler and Wellburn (1985) استفاده شد. 1/0 گرم از وزن تر برگ به همراه 5 میلی لیتر استون 80 درصد در هاون چینی ساییده شد. عصاره حاصل به مدت 10 دقیقه در 2500 دور، سانتریفیوژ شد. سپس جذب فاز بالایی هر یک از نمونههای سانتریفیوژ شده توسط اسپکتروفتومتر در طول موجهای 662 نانومتر، 645 نانومتر و 470 نانومتر اندازهگیری

  • 1
]]>