ق منافذ پلاسمودسمی از محل تولید خود (سلولهای همراه آوند آبکش) به عناصر آوند آبکش ؛ ب) تجمع رونوشت های ژنی آنزیم های درگیر در بیوسنتز آلکالوئیدهای خشخاش <br/” title=”br”>br />
هر کدام از آنزیم¬های درگیر در مسیر بیوسنتز مرفین هم در گیاهان و هم در کشت سوسپانسیون سلولی P. somniferum تشخیص داده شده¬اند. اما کشت سلول گیاهی هرگز تجمع مرفین یا کدئین را نشان نداده است ( Kutchan، 1998). ثابت گردیده است که تجمع مرفین در گیاه وابسته به سیستم تمایز آوندهای آبکش باشد (شکل 1-6) (Hung و همکاران، 2000).

شکل 1-6- تصویر سه بعدی از بافت آوندی در خشخاش: محل قرارگیری عناصر آبکشی (زرد رنگ)، سلول همراه و لاتیسیفرها (محل تجمع لاتکس) که در بیوسنتز و تجمع آلکالوئیدها نقش دارند.

تخریب مراحل آنزیمی ویژه از طریق خاموشی ژن¬ها می¬تواند اطلاعات مفیدی را درباره مسیرهای کنترل فراهم آورد. نحوه بیان آنزیم CodR نشان می¬دهد که این یک آنزیم کلیدی و اساسی است که توسط تیمار با محرکها (Elicitors) یا زخمی¬کردن (Park و Facchini، 2003) القاء نمی¬شود. کدئین به عنوان پیش ماده بیوسنتزی مرفین می¬باشد.
در طول مسیر بیوسنتزی مرفین، آنزیم کدئینون ردوکتاز (Codeinone reductase) واکنش تبدیل کدئینون به کدئین را کاتالیز می¬کند که یک واکنش احیاء وابسته به NADP است. کلونینگ ژن CodR به عنوان آنزیم ماقبل آخر سنتز مرفین است دارای اهمیت زیادی می¬باشد. از طرف دیگر تأثیر ساختارهای سنجاق سری (Hairpin RNA) در خاموشی ژن در گیاهان ثابت شده است (Vasili و همکاران، 2001). استفاده از این روش اجازه خاموش کردن یک یا چند یا تمام اعضای خانواده چند ژنی (Multigene family) توسط توالی¬های هدفمند را که اختصاصی یا مشترک می¬باشند را فراهم می¬کند. لازم به ذکر است که آنزیم CodR توسط یک خانواده چند ژنی کد می¬شود. Robert و همکاران در سال 2004 با استفاده از ساختارهای سنجاق سری RNA شیمریک موفق به خاموشی تمام اعضای خانواده CodR از طریق RNAi گردیدند. پس از خاموشی ژن میزان آلکالوئید اس-رتیکولین به عنوان پیش ماده سنتز مرفین در غیاب مرفین، کدئین، اریپاوین و تبائین در گیاهان تراریخت افزایش یافت. مشتقات متیله رتیکولین نیز در این آزمایشات افزایش یافت. آنالیزها نشان از حذف رونوشت¬های ژن CodR و کاهش فعالیت آنزیمی آن داشتند. تجمع اس- رتیکولین نشان¬دهنده وجود مکانیسم پس¬نورد (Feedback) دارد که از بوجود آمدن واسطه¬های معمول مسیر بیوسنتز مرفین جلوگیری می¬کند. با این حال بر روی سطوح رونوشت هفت آنزیم دیگر در مسیر بیو¬سنتز تأثیری نداشت.

1-7-2- ساختار ناقلین ژن و پلاسمید Ri
ژن¬های موجود در ژنوم هسته¬ای گیاه از چند منطقه مختلف تشکیل شده و هر منطقه نقش خاصی را در نسخه برداری و ترجمه mRNA بر عهده دارد. این نواحی شامل تشدید کننده ، پروموتور و خاموش کننده و توالی کدکننده است. گیاهان را معمولاً با ساختارهای نسبتاً ساده ای که در آن¬ها ژن مورد نظر با یک پروموتور مناسب، یک توالی رهبر در انتهای َ5 و یک خاتمه¬ دهنده در انتهای َ3 جفت می¬شود، تراریخت می¬کنند، تا از نسخه برداری، پایداری و ترجمه موثر mRNA اطمینان حاصل گردد. پروموتور می¬تواند از یک منبع گیاهی، ویروسی و یا باکتریایی باشد. غالباً از پروموتور با منشا ویروس موزائیک گل کلم (CaMV35S) استفاده می¬شود، زیرا که این پروموتور متعلق به یک ویروس گیاهی است و ویروس-های گیاهی به فاکتورهای نسخه¬برداری و ترجمه در گیاهان وابسته¬اند. این پروموتور حد بالایی از بیان ژن را در اغلب بافت¬ها هدایت می¬نماید ( Adkinz و همکاران، 1990).
ناقل ژن گیاهی، به ناقلینی گفته می¬شود که از توانایی انتقال اطلاعات ژنتیکی در بین گیاهان و انتقال اطلاعات ژنتیکی از دیگر موجودات (باکتری¬ها، قارچ¬ها و حیوانات) به گیاهان برخوردارند. ناقلینی که برای انتقال ژن به گیاهان مورد استفاده قرار می¬گیرند عبارتند از پلاسمیدهای اگروباکتریوم، ویروس¬ها و عناصر متحرک ( Paulez و همکاران، 1995).
جنس اگروباکتریوم باکتری گرم منفی ، میله ای شکل و خاکزی می باشد. بعضی از جنس های این خانواده از قبیل A. tumefaciens، A. rhizogenes و A. rubi برای گیاهان بیماری زا بوده و جنس دیگر از این باکتری ها مانند A. radiobacter غیر بیماری زا می باشد. در میان این باکتری ها A. tumefaciensوA. rhizogenes به خوبی شناخته شده اند. این دو باکتری در چندین گیاه دو لپه ای و نیز تعدادی ازگیاهان تک لپه، باعث ایجاد ناهنجاری در تکثیر سلول های گیاهی در محل آلودگی و در نهایت ایجاد تومور توسط A. tumefaciens و ریشه های نابجا (ریشه مویی) توسط A. rhizogenes می شوند.
چهار نوع پلاسمید Ri وجود دارد که شامل اگروپین(agropine)، مانوپین(manopine)، کوکوموپین(cucumopine) و میکیموپین(mikimopine) هستند. نژادهای اگروپین دارای T-DNA راست و چپ هستند. ناحیه TL شامل هجده ORF (Open Reading Frame) است که دارای چندین منطقه ژنی است که به آنها rol (root loci) گفته می شود که مسئول القای ریشه مویی هستند. TL از لحاظ اندازه ثابت تر است. از بین آنها محصولاتی که توسط لوکوس rol A,B,C کد می شوند که دارای اثر همکاری روی القای ریشه و ایجاد حساسیت شدید نسبت به اکسین می باشند. این سه ژن برای القای ریشه مویی کافی می باشند(Bonhomme و همکاران،2000). TR-DNA در باکتری ممکن است مسئول تشکیل کالوس و فنوتیپ رشد کند باشد. نبود TR-DNA موجب فقدان تولید اپین در ریشه مویی است(Batra و همکاران 2004)
سویه های Agropine به دلیل ویژگی القایی قوی¬ای که دارند، بیشترین سویه مورد استفاده هستند. ریشه-های مویین حاصل از تلقیح با گونه¬های آگروباکتریوم قادر به کشت در شرایط درون شیشه¬ای هستند. بی¬نیاز بودن آنها به هورمون، نتیجه بیان پایدار ژن های T-DNA درون آنهاست (Zupan and Zambryski 1995). این ژن¬ها موجب افزایش حساسیت سلولها به اکسین می گردند (ژن¬های rol پلاسمید Ri) (Tepfer 1990).
پلاسمیدهای TiوRi از نظر ساختار و ترکیب شبیه یکدیگر هستند. هر دو پلاسمید ژن¬هایی دارند که مسئول پردازش، اتصال و انتقال T-DNA به سلول¬های گیاهی هستند. علی رغم شباهت های بسیار، تفاوت های کمی بین دو پلاسمید وجود دارد. در پلاسمید Riو Ti، T-DNA در بین دو توالی بلند 25 جفت بازی از تکرار های مستقیم ناقص قرار گرفته است که توالی های مرزی نامیده می شوند (Yadav و همکاران؛ 1982). مرز سمت راست (RB) برای تومور زایی/ ریشه زایی کارآمد و ضروری می باشد (Shaw et al., 1984, Wang et al., 1984). مرز سمت چپ (LB)، برخلاف مرز سمت راست، برای تومور زایی/ ریشه زایی غیر ضروری است. پلاسمید های Ri توالی های تکراری 8 جفت بازی به نام T-DNA transfer stimulator sequences(TSS) را دارند که بازده انتقال T-DNAرا به ژنوم گیاه افزایش می دهند . TSSدر سویه هایmikimopine شامل ، 6 تکرار از توالی 5´-ATTAGTTC-3´در سویه هایagropine دارای 12 تکرار از توالی ´ 5´-TGCCTTG-3، در سویه های mannopine، 16 تکرار از توالی ´ 5´-GTTCGTCA-3در سویه های cucumopine ، دارای 5 تکرار از توالی´ 5´-TTGTTCAA-3 می باشند. تفاوت دیگر میان این دو پلاسمید، عدم وجود ژن های virE1 و virE2 در ژنوم و پلاسمید Ri اگروباکتریوم رایزوژنز است. محصول ژن virE2 یک پروتئین متصل شونده به DNA است و نقش آن حفاظت از T-DNA تک رشته ای در برابر حمله نوکلئازها است. اگروباکتریوم رایزوژنز به جای آن دارای ژن GALLS می باشد. هر دو ژن¬های virE2 و GALLS دارای توالی¬های جابجا کننده به سمت هسته می باشند.
همان طور که گفته شد اگروباکتریوم رایزوژنز دارای ژن GALLS روی پلاسمید Ri است که می تواند جایگزین عملکرد virE2 در اگروباکتریوم تومی فاشینس باشد. GALLS شامل موتیف های هلیکاز و متصل شونده به ATP است. T-DNA این پلاسمید حاوی ژن های ایجاد کننده ریشه (rol gene) است. پلاسمید¬هایی با دو T-DNA (راست و چپ) Split T-DNA نامیده می شوند. پلازمید Ri سویه های mannopineو cucumopin فقط یک ناحیه T-DNA دارند در حالی که سویه های agropine دو ناحیه T-DNA دارند که هر کدام 15 تا 20 کیلوباز طول دارند. اگر چه هر دو T-DNA به طور مستقل منتقل شده و در ژنوم گیاه ادغام می شوند، انتقال TL-DNA که حاوی ژن های rol است برای ایجاد ریشه موئی ضروری است. TR-DNA حاوی ژن ها aux1, aux2, RolB TR, mas 1, mas 2, ags است که بیوسنتز اکسین و اپین را کنترل می کنند. TR شامل ژن¬های سنتزکننده اکسین، اپین های مانیتیل (manityl) و اگروسین (agrocine) می باشد. خانواده اپین های مانیتیل که در آن مانوز، گلوتامین یا گلوتامیک اسید وجود دارند، شامل مانوپین، مانوپینیک اسید، اگروپین و اگروپینیک اسید می باشند(Dessaux وهمکاران، 1992). اپین های مانیتیل (manityl ) تجمع بالایی (حدود ده درصد وزن خشک) در گیاهان توتون تراریخت و ریشه مویی نشان می دهند(Sarka و همکاران، 1992؛ Saito وهمکاران،1992). آنها نمی توانند به آسانی توسط گیاهان متابولیزه شده و به فضای خارج سلولی آزاد شوند. بنابراین بیوسنتز اپین ها در ناحیه TR متابولیسم اولیه را در تولید اپین جهت می دهد و بنابراین ممکن است به طور بالقوه منبع کربن و نیتروژن در دسترس برای تولید متابولیت¬های ثانویه را کاهش دهد.
ژن rolA در سویه های مختلف اگروباکتریوم رایزوژنز 279 تا 423 جفت باز طول دارد. رونوشت آن بیش از دو کیلوبازاست و وارد توالی ژن rolB می شود و منجر به ایجاد یک پیام آنتی سنس برای rolB می گردد. این مشاهدات امکان وجود یک مکانیسم تنظیمی که از بیان با هم rolB و rolA جلوگیری می کند، را نشان می دهد. rolB بر اساس نوع سویه 762 تا 837 جفت باز طول دارد. overexpress ژن rolB به وسیله یک پروموتر دائمی مانع ایجاد ریشه می شود. بنابراین سطح درستی از بیان این ژن برای فعالیت و رشد ریشه مویی لازم است. ژن rolB بتا گلوکوزیداز را کد می کند که می تواند اکسین را از طریق هیدرولیز بتا گلوکوزید ایجاد کند. بیان rolB می تواند در حساسیت اکسین تغییر ایجاد می کند، اگرچه میزان اکسین واقعی را تغییر ندهد.
علاوه بر این مطالعات از طریق فعال کننده ها یا مهار کننده های بیوسنتز اکسین نشان داده است که rolB می تواند نقش مهمی را در مراحل اولیه ایجاد ریشه مویی ایفا کند. rolB همچنین خاصیت تیروزین فسفاتازی دارد و پیشنهاد می شود که در آبشار کیناز/فسفاتاز در طی سیگنالینگ پاسخ اکسین، نقش دارد. مطالعات نشان داده است که پروتئین rolBبا پروتئین های Nicotiana tobacum 14-3-3 میانکنش می کند و بیان آن مرتبط با میانکنش با این پروتئین ها در طی مراحل اولیه ایجاد ریشه در هسته است. در گیاهان این پروتئین ها به عنوان پروتئین های تنظیمی در انواع مختلفی از پروسه های زیستی از طریق میانکنش با تعداد زیادی از پروتئین های هدف در مسیر وابسته به فسفوریلاسیون عمل می کنند. پروتئین 14-3-3، H-ATPase القا شونده با اکسین را که در تغییر پتانسیل غشا نقش دارد تنظیم می کند.
توالی rolC حدود 540 جفت باز دارد و پروتئین هایی با 179 تا 181 آمینو اسید را کد می کند. Overexpress این ژن منجر به القا ژن هایی که در مکانیسم های دفاعی نقش دارند، مثل بتا 1،3 گلوکاناز می شود. پس بیان این ژن پاسخ های دفاعی گیاه را فعال می کند. پروموتر این ژن به میزان زیادی به وسیله ساکارز القا پذیر است.
rolD که در سویه های نوع agropine یافت می شود، 1032جفت باز طول دارد و پروتئینی با 344 آمینواسید را کد می کند که یک آنزیم اورنیتین سیکلودآمیناز است و تبدیل اورنیتین به پرولین را کاتالیز می کند. علاوه بر این ژن ها T-DNA شامل ژن هایی است که خیلی شناسایی نشده اند. تعدادی از آن ها مثل ORF 3,8,13 در بین پلاسمیدهای Riبه میزان زیادی حفاظت شده هستند( .(Veena & Taylo; 2007 شکل 1-7 ساختار پلاسمید Ri در آگروباکتریوم رایزوژنز را نشان می دهد.

مطلب مرتبط :   دینی، روشنفکری، دین، روشنفکران، مدرنیته، حکومت