دانلود مقاله تحقیق پایان نامه

تحقیق درباره پایان نامه، اطمینان

9/10 گرم [do_widget id=kl-erq-2]
مواد مذکور را در 800 میلی لیتر آب مقطر حل کرده و سپس با آب مقطر به حجم 1000میلی لیتر رسانده شد.
لازم به ذکر است که میتوان از بافر TBE (0.5X) نیز برای الکتروفورز استفاده کرد. به شرط آنکه ژل آگارز را نیز با همان غلظت از بافر TBE تهیه نمود که در این پایان نامه نیز تمامی ژلهای آگارز با TBE (0.5X) ساخته شد.
قبل از تهیه ژل آگارز، سینی مخصوص ژل را آماده و شانه مخصوص در سینی قرار داده شد. فاصله شانه تا کف سینی معمولاً باید 2 تا 3 میلی متر باشد. سپس بسته به ظرفیت سینی ژل برای ایجاد چاهک مناسب( مثلاً در اینجا 40میلی لیتر) ، مقدار 4/0 گرم پودر آگارز را در 40 میلی لیتر بافر TBE حل شد تا ژل 1% فراهم شود. سپس روی شعله متوسط حرارت داده تا پودر آگارز حل شد و محلول کاملاً شفاف شد. حال کمی صبر کرده تا محلول کمی سرد شده(حدود 55 درجه) و سپس 1میکرولیتر از رنگ اتیدیوم بروماید(mg/ml10) به آن افزوده شد، 10 بار بصورت عدد 8 لاتین هم زده و در سینی ژل دارای شانه ریخته شد تا سرد شود. پس از اطمینان از بسته شدن کامل ژل، به آرامی شانه را از داخل آن درآورده و سینی حاوی ژل داخل تانک الکروفورز قرار داده شد. سپس 5میکرولیتر از نمونه را با 1میکرولیتر از لودینگ دای (X6) مخلوط و به آرامی از بالای چاهک به داخل آن ریخته شد.
3-8- بررسی بیان پروتئین porA با روش SDS-PAGE
یکی از روشهای بررسی بیان پروتئین ، روش SDS-PAGE است که برای شناسایی و بررسی کیفیت و کمیت پروتئین مورد استفاده است. SDS-PAGE براساس روش پیشنهادی لاملی (1970) انجام گرفت. برای این منظور از استوک باکتری (که روش تهیه آن را در بالا توضیح داده شد) روی محیط کشت جامدال بی آگار حاوی امپی سیلین کشت خطی داده شد و در انکوباسیون 37 درجه به مدت 18 ساعت انکوبه گردید. سپس 5 کلنی از پلیت تازه رشد کرده به 20میلی لیتر ال بی براث آمپی سیلین دار تلقیح گردید و در انکوباتور شیکردار در دمای 37 درجه ی سانتیگراد با دور rpm170 قرار گرفت. بعد از 4 ساعت و پس از آنکه OD به 8/0رسید به آن IPTG اضافه شد( به ازای هر 1میلی لیتر محیط کشت به ان 2 میکرولیتر IPTG اضافه شد)سپس در همان لحظه یعنی ساعت صفر 2 میلی لیتر از محتوای فلاسک در شرایط استریل به میکروتیوپ 2 میلی لیتری انتقال داده شد. بعد نمونه درrpm 13000 به مدت 5 دقیقه میکروفیوژ شد و محلول رویی کاملا تا قطره اخر دورریخته شد ورسوب به عنوان پروتئین تولید شده در ساعت صفر به یخچال منتقل شد و فلاسک ارلن مایر روی شیکر انکوباتور قرار گرفت.این کار(رسوب گیری باکتری هر 1 ساعت یکبار) در 5 ساعت متوالی انجام شد و به عنوان رسوب تولید شده ی باکتری در ساعات اول و دوم و سوم و چهارم و پنجم در نظر گرفته شد. حال برای بررسی بیان پروتئین در این 5 ساعت ، روی ژل پلی اکریل آمید( SDS-PAG)
به شرح زیر الکتروفورز گردید.
-الکترفورز بر روی ژل پلی آکریل آمید- SDS-PAG
3-9- نحوه آماده سازی جایگاه ژل
پس از آماده سازی صفحات شیشه ای ،صفحات با گیره های مخصوص بسته شد و به صورت عمودی در محل نگه دارنده ی صفحات قرار گرفت.سپس برای تهیه ی ژل SDS-PAGE به سه نوع بافر که در زیر ذکر شده است نیاز است.
بافرهای مورد نیاز: در این روش به سه نوع بافر نیاز است:
الف) بافرجدا کننده 12% :اجزا و مقادیر این بافر در جدول3-1 نشان داده شده است.
ب)بافر متراکم کننده 6%: اجزا و مقادیر این بافر در جدول 3-2 نشان داده شده است.
ج)بافر تانک برای برقراری جریان:اجزا و مقادیر این بافر در جدول3-3 نشان داده شده است.
3-10- روش تهیه بافر جداکننده
ابتدا به استوک آکریل آمید و بیس آکریل آمید آماده شده تریس و SDS و آمونیوم پرسولفات (APS)به مقدار اشاره شده در جدول 3-1 اضافه شد ، سپس حجم محلول با 8/4 میلی لیتر آب مقطر به 15 میلی لیتر رسانده شد و در آخر تمد به مقدار ذکر شده در جدول3-1 اضافه گردیدپس از ترکیب مواد زیر، بافر جدا کننده حاصل شده توسط سمپلر در محل موردنظر (بین صفحات شیشه ای)قرار گرفت . پس از قرار گیری بافر جدا کننده بین صفحات شیشه ای 15 دقیقه برای سفت شدن کامل ژل، فرصت داده شد.
جدول3-1 : بافرجدا کننده 12%
مقدار ماده
غلظت ماده
نوع ماده
3ml
30%
]]>