پایان نامه تاثیر کاهش حجم مایع بلاستوسل قبل از انجماد شیشه ای بر بیان ژنهای اختصاصی اندودرم اولیه رویان موش
وزارت علوم، تحقیقات و فناوری
پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری
پژوهشکده زیست فناوری پزشکی
پایان نامه كارشناسی ارشد
در رشته زیست شناسی سلولی- مولکولی
عنوان:
تاثیر کاهش حجم مایع بلاستوسل قبل از انجماد شیشه ای بر بیان ژنهای
اختصاصی اندودرم اولیه رویان موش
اساتید راهنما:
دکتر مجتبی دشتیزاد
دکتر قاسم آهنگری
استاد مشاور:
دکتر مهدی شمسآرا
اسفند ماه سال 1393
(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
فهرست مطالب
1 مقدمه و مروری بر مطالعات انجام شده2
1-1 تکوین پیش از لانهگزینی در موش3
1-1-3 مکانیسمهای مولکولی دخیل در لایهزایی رویان. 9
1-1-3-1 جدایی دو ردهی سلولی تروفواکتودرم و توده سلولی داخلی.. 10
1-1-3-2 جدایی دو ردهی سلولی اپیبلاست و اندودرم اولیه. 11
1-2-2 کشت آزمایشگاهی رویان. 15
1-2-3-3-2 انجماد شیشه ای.. 21
2-2-1-1 آماده سازی محیط و قطرهها 26
2-2-1-2 جابجایی مهرهی گردنی.. 27
2-2-1-3 تشریح موش نر و جداسازی اپیدیدیم. 28
2-2-1-4 جمعآوری و ظرفیتپذیری اسپرم. 29
2-2-2-1-1 تزریق داخل صفاقی.. 31
2-2-2-2 آماده سازی محیط و قطرهها 32
2-2-2-3 جابجایی مهرهی گردنی.. 32
2-2-2-4 تشریح موش ماده و جداسازی لولهی تخمبر. 32
2-2-2-5 جداسازی تودهی تخمک-کومولوس… 33
2-2-3-1 آماده سازی محیط و قطرهها 34
2-2-4-1 آماده سازی محیط و قطرهها 35
2-3-1 تحریک تخمکگذاری و جفت اندازی موشها 37
2-3-2 آماده سازی محیط و قطرهها 37
2-3-3 جابجایی مهرهی گردنی.. 37
2-3-4 تشریح موش ماده و جداسازی لولههای رحمی.. 37
2-4 سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست39
2-4-1 آماده سازی محیط و قطرهها 39
2-4-2 آماده سازی و تنظیم دستگاه ریزدستکاری.. 40
2-5-1-1 آماده سازی محیط و قطرهها 41
2-5-2-1 آماده سازی محیط و قطرات… 43
2-6-1 استخراج RNA از بلاستوسیست… 45
2-6-5 واکنش زنجیرهای پلیمراز. 48
2-6-6 ژل الکتروفورز محصولات PCR.. 49
2-6-7 واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی.. 49
2-7-1 کاهش مایع بلاستوسل رویانهای درونتنی موش، قبل از انجماد شیشه ای52
2-7-2 کاهش مایع بلاستوسل رویانهای برونتنی موش، قبل از انجماد شیشه ای..52
3-1 کاهش مایع بلاستوسل رویانهای درونتنی موش قبل از انجماد شیشه ای……………54
3-1-1 نرخ زندهمانی و خروج از زونا 54
3-1-2 بیان نسبی ژنهای Gata6 و Grb2. 56
3-1-2-1 واکنش زنجیرهای پلیمراز. 56
3-1-2-2 واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی.. 57
3-2 کاهش مایع بلاستوسل رویانهای برونتنی موش قبل از انجماد شیشه ای.62
3-2-1 نرخ زندهمانی و خروج از زونا 62
3-2-2 بیان نسبی ژنهای Gata6 و Grb2. 64
فهرست جداول
جدول 1‑1: ترکیبات محیط HTF. 14
جدول 1‑2: ترکیبات محیط KSOM.. 16
جدول 2‑1: محلولهای مورد نیاز برای انجماد شیشه ای بلاستوسیست موش.. 42
جدول 2‑2: محلولهای مورد نیاز برای یخگشایی بلاستوسیست موش.. 44
جدول 2‑3: مواد مورد استفاده جهت ساخت cDNA. 46
جدول 2‑4: چرخههای حرارتی ساخت cDNA. 46
جدول 2‑5: مشخصات پرایمرهای طراحی شده 47
جدول 2‑6: مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز 48
جدول 2‑7: چرخههای حرارتی مراحلPCR 48
جدول 2‑8: مواد مورد نیاز جهت انجام Real Time PCR. 50
جدول 2‑9: چرخههای حرارتی Real Time PCR. 50
جدول 3‑1: میزان زندهمانی و میزان خروج از زونای بلاستوسیست درونتنی موش.. 55
جدول 3‑2: میزان زندهمانی و میزان خروج از زونای بلاستوسیست برونتنی موش. 63
فهرست اشکال
شکل 1‑1: مراحل مختلف تکوین پیش از لانهگزینی در موش.. 2
شکل 1‑2: بخشهای مختلف لولهی تخمبر. 3
شکل 1‑6: تقسیم مرحله 8 به 16 سلولی. 7
شکل 1‑7: تشکیل حفرهی بلاستوسل. 7
شکل 1‑8: آرایش سیستمهای انتقالی در سلولهای تروفواکتودرم 8
شکل 1‑9: بلاستوسیست در حال خروج از زونا 9
شکل 1‑10: مسیر تمایز رده تروفواکتودرم در موش. 10
شکل 1‑11: جدایی دو رده سلولی اندودرم اولیه و اپیبلاست در سه مرحله 11
شکل 1‑12: دخالت مسیر پیامرسان FGF/MAPK 13
شکل 1‑13: فرایند شیشه ای شدن محیط انجماد. 21
شکل 1‑14: روشهای مختلف سوراخ کردن مصنوعی حفرهی بلاستوسل. 24
شکل 2‑1: قفسهای دارای سیستم تهویهی مجزا 26
شکل 2‑2: پتری دیش استحصال اسپرم 27
شکل 2‑3: جابجایی مهرههای گردنی. 28
شکل 2‑6: نحوه جمعآوری اسپرمهای زنده از حاشیه قطرهی محیط کشت.. 30
شکل 2‑7: نحوه ترزیق داخل صفاقی موش.. 31
شکل 2‑8: پتری دیش استحصال تخمک.. 32
شکل 2‑9: جداسازی لولهی تخمبر. 33
شکل 2‑10: جداسازی تودهی تخمک-کومولوس.. 34
شکل 2‑12: تخمک-کومولوسهای مجزا 35
شکل 2‑13: نحوه قطرهگذاری محیط KSOM در پلیت کشت رویان. 36
شکل 2‑14: جداسازی لولههای رحمی. 38
شکل 2‑15: استحصال بلاستوسیست از لولهی رحمی. 39
شکل 2‑16: پتری دیش ریز دستکاری. 40
شکل 2‑17: نحوه سوراخ کردن حفرهی بلاستوسیست.. 41
شکل 2‑18: نحوه قطرهگذاری محلولهای انجماد شیشه ای. 42
شکل 2‑19: موقعیت قرار گیری بلاستوسیست بر روی کرایوتاپ 43
شکل 2‑20: پتری دیش حاوی محلول یخگشایی. 44
شکل 3‑1: بلاستوسیستهای درونتنی موش بعد از انجماد-ذوب در محیط KSOM.. 56
شکل 3‑2: الکتروفورز محصولات PCR بر روی ژل آگارز. 57
شکل 3‑3: منحنی استاندارد ژنهای Grb2، Gata6 و B2m 58
شکل 3‑4: منحنی تکثیر ژنهای Grb2، Gata6 و B2m. 59
شکل 3‑5: منحنیهای ذوب مربوط به ژنهای Grb2، Gata6، B2m. 60
شکل 3‑6: اثر تیمارهای مورد آزمایش بر روی بیان نسبی ژن Gata6. 61
شکل 3‑7: اثر تیمارهای مورد آزمایش بر روی بیان نسبی ژن Grb2. 62
شکل 3‑8: مراحل مختلف رشد و تکوین رویان موش پیش از لانهگزینی. 63
شکل 3‑9: اثر تیمارهای مورد آزمایش بر روی بیان نسبی ژن Gata6. 64
شکل 3‑10: اثر تیمارهای مورد آزمایش بر روی بیان نسبی ژن Grb2 65
چکیده فارسی
مطالعات انجام شده در سالهای اخیر نشان می دهند که سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست قبل از انجماد شیشه ای، در بهبود کیفیت رویانهای ذوب شده موثر است. اما در این مطالعات، به نقش آب درون حفره و تاثیر آن بر روی تشکیل ردههای سلولی بلاستوسیست، توجه نشده است. بنابراین در تحقیق حاضر، علاوه بر ارزیابی نرخ زندهمانی و خروج از زونا، اثر کاهش مایع بلاستوسل قبل از انجماد شیشه ای، بر روی میزان بیان ژنهای Gata6 و Grb2 در بلاستوسیست درونتنی و برونتنی منجمد-ذوب شده و سوراخ شده قبل از انجماد بررسی شد و با گروه کنترل مقایسه گردید. در این مطالعه، میزان خروج از زونا با سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست قبل از انجماد، بهصورت معنیداری افزایش یافت. این در حالی است که میزان زندهمانی در گروههای تحت تیمار، مشابه با گروه کنترل، بالا بود. انجماد شیشه ای موجب افزایش در میزان بیان ژنهای Gata6 و Grb2 شد (p<0.05). اما با کاهش مایع بلاستوسل قبل از انجماد، در بلاستوسیستهای درونتنی، میزان بیان این ژنها نسبت به گروه انجماد شیشه ای بهصورت معنیداری کاهش پیدا کرد و به گروه کنترل نزدیک شد (p<0.05). در حالی که در مورد بلاستوسیستهای برونتنی، با بهره گرفتن از این تکنیک، بیان ژن Grb2 افزایش پیدا کرد ولی تفاوت معنیداری در میزان بیان ژن Gata6 نسبت به گروه انجماد شیشه ای ایجاد نشد. از آنجایی که هیچ نتیجهای مبنی بر تاثیر منفی استفاده از این تکنیک مشاهده نگردید و با توجه به افزایش میزان خروج از زونا، کاهش حجم مایع بلاستوسل قبل از انجماد شیشه ای می تواند مفید واقع شود.
کلمات کلیدی: لقاح آزمایشگاهی، انجماد شیشه ای، سوراخ کردن مصنوعی، بیان ژن، Real Time PCR
مقدمه و مروری بر مطالعات انجام شده
تکوین قبل از لانهگزینی[1]، در همهی PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران با یک سلول منفرد به نام تخم[2] آغاز می شود و با ایجاد بلاستوسیست[3] از طریق چندین تقسیم متوالی، پایان مییابد (Rossant and Tam, 2009). مطالعه در مورد رخدادهای این دوره، برای افزایش موفقیت در تکنیکهای کمک باروری[4] الزامی است. بیشتر اطلاعات ما درباره تکوین قبل از لانهگزینی، از مطالعه بر روی موش بدست آمده است. از مزایای استفاده از موش میتوان به تعداد نژادهای بسیار زیاد، تشابه ژنتیکی بالا با انسان، ارزان بودن گونه موش نسبت به سایر گونه ها، دوران بارداری کوتاه، تعداد زیاد نوزادان در هر دوره بارداری، سایز کوچک و نگهداری آسان اشاره کرد. بر همین اساس، استفاده از این مدل آزمایشگاهی در تحقیقات مربوط به فرایندهای تولیدمثلی و تکنیکهای کمک باروری رایج میباشد.
تعداد صفحه : 103
قیمت :14700 تومان
بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد
و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.
پشتیبانی سایت : * serderehi@gmail.com
در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.
[add_to_cart id=151811]
