دانلود پایان نامه

سپس از این محیط 4 قطره با حجم تقریبی l 250، در پتری دیش mm60×15 گذاشته و سطح آنها با روغن معدنی استریل پوشانده شد (شکل ‏28). پتری دیش حداقل به مدت 4 ساعت در انکوباتور با دمای C 37، رطوبت 97% و CO2 به میزان 5% قرار گرفت.

شکل ‏28: پتری دیش استحصال تخمک

2-2-2-3 جابجایی مهرهی گردنی
حدود 16-14 ساعت پس از تزریق hCG، موشهای ماده، به روش جابجایی مهرهی گردنی، مطابق 3-2-1-2 کشته شدند.

2-2-2-4 تشریح موش ماده و جداسازی لولهی تخمبر116
مراحل اولیهی تشریح، مانند بخش 3-2-1-3 انجام و حفرهی شکمی موش ماده نمایان گشت. با کنار زدن احشای شکمی و کشیدن لولهی رحمی به سمت بالا و خارج از حفره، موقعیت تخمدان117 و لولهی تخمبر مشخص شد. سپس بافت چربی و پردهی مزومتریوم اطراف آنها به کمک پنس حذف گشت (شکل ‏29). دو طرف لولهی تخمبر، برش خورد و در قطرهی M2 قرار گرفت.

شکل ‏29: جداسازی لولهی تخمبر الف: موقعیت لولههای رحمی در حفرهی شکمی (فلشهای سیاه) ب: لولهی رحمی گرفته شده با پنس 1: لولهی رحمی 2: لولهی تخمبر 3: تخمدان، محلهای برش جهت جداسازی لولهی تخمبر با خطوط سیاه نشان داده شده

2-2-2-5 جداسازی تودهی تخمک-کومولوس118
در این مرحله، لولههای تخمبر قرار گرفته در قطرهی M2، توسط یک جفت سوزن استریل، از ناحیهی آمپولا پاره و تودههای تخمک-کومولوس خارج شدند (شکل ‏210).

این تودهها، با استفاده از پیپت ضخیم، در قطرات M2 شستوشو و در نهایت درون انکوباتور با دمای شC 37، رطوبت 97% و CO2 به میزان 5% نگهداری شدند. این مراحل در زیر استرئومیکروسکوپ مجهز به صفحهی گرم کننده با دمای یC 37 انجام شد.

شکل ‏210: جداسازی تودهی تخمک-کومولوس الف: لولهی تخمبر جدا شده در زیر استرئومیکروسکوپ، ناحیهی متورم آمپولا با فلش سیاه نشان داده شده (بزرگنمایی 30×) ب: تودهی تخمک-کومولوس خارج شده از لولهی تخمبر (بزرگنمایی 40×)
.
2-2-3 لقاح آزمایشگاهی
2-2-3-1 آمادهسازی محیط و قطرهها
در لقاح آزمایشگاهی از محیط HTF که مشابه بخش 3-2-1-1 آماده شده بود، استفاده گردید. از این محیط، 4 قطره با حجم تقریبی l 250 در پتری دیش mm 60×15 برای شستوشو و 7-5 قطره با حجم تقریبی l 50 در پتری دیش mm 35×10 (153063,Nunc, Denmark) گذاشته و سطح آنها با روغن معدنی استریل پوشانده شد (شکل ‏211). سپس پتری دیشها حداقل به مدت 4 ساعت در انکوباتور با دمای C 37، رطوبت 97% و CO2 به میزان 5% قرار گرفتند.

شکل ‏211: پتری دیش IVF

2-2-3-2 لقاح
تودههای تخمک-کومولوس جمعآوری شده (3-2-2-5)، درون قطرههای l 250 محیط HTF، شستوشو داده شدند تا تخمک-کومولوسهای مجزا حاصل گردد (شکل ‏212). سپس حدود 15-10 عدد تخمک با ظاهر طبیعی به هر قطرهیHTF با حجم l 50 منتقل و اسپرم ظرفیتپذیر شده مطابق 3-2-1-4، به این مجموعه اضافه گردید. این مراحل در زیر استرئومیکروسکوپ مجهز به صفحهی گرم کننده با دمای یC 37 انجام شد. در نهایت پتری دیش به مدت 4 ساعت در انکوباتور با دمای C 37، رطوبت 97% و CO2 به میزان 5% قرار گرفت.

شکل ‏212: تخمک-کومولوسهای مجزا (بزرگنمایی 200×)

2-2-4 کشت آزمایشگاهی119
2-2-4-1 آمادهسازی محیط و قطرهها
برای کشت رویان از محیط کشت KSOM (Lawitts and Biggers, 1993) به همراه mg/ml 22 سدیم پیروات، mg/ml 1 آلبومین سرم گاوی،g/ml µ 50 جنتامایسین120 (L0011-010, Bio west) و ng/ml 50 فاکتور رشد اپیدرمی121 (E4127, Sigma) استفاده شد (پیوست الف-3). از این محیط 4 قطره با حجم تقریبی l 250 در پتری دیش mm 60×15 برای شستوشو و وl 400 در هر چاهک پلیت چهار حفرهای (Nunc, Denmark176740,) به منظور کشت رویان گذاشته و با روغن معدنی استریل پوشانده شد (شکل ‏213). سپس حداقل به مدت 4 ساعت در انکوباتور با دمای C 37، رطوبت 97% و CO2 به میزان 5% قرار گرفت.

شکل ‏213: نحوهی قطرهگذاری محیط KSOM در پلیت کشت رویان

2-2-4-2 کشت رویان122
در زیر استرئومیکروسکوپ و بر روی صفحهی گرم کننده با دمای یC 37، از بین تخمکهای لقاح یافتهی حاصل از IVF (3-2-3-2) آنهایی که از نظر ظاهر، طبیعی بودند انتخاب و پس از شستوشو در قطرههای KSOM، به چاهکهای پلیت کشت رویان منتقل شدند (در هر چاهک 80-70 عدد سلول تخم). سپس پلیت مورد نظر، به منظور گذر سلول تخم از مراحل مختلف تکوینی و رسیدن رویانها به مرحلهی بلاستوسیست، به مدت 72 ساعت در انکوباتور با دمای بC 37، رطوبت 97% و CO2 به میزان 5% نگهداری شد (شکل ‏38). پس از سپری شدن 48 ساعت از زمان مورد نظر، به منظور تعویض محیط، l 200 محیط KSOM از هر چاهک پلیت کشت رویان، با همین حجم محیط KSOM تازه و تنظیم شده123 با شرایط انکوباتور جایگزین شد.

2-3 تولید رویان درونتنی
برای این منظور، از موشهای ماده با سن 8-7 هفته استفاده شد.

مطلب مرتبط :   ارتکاب جرم، بهداشت روان، مواد مخدر، مصرف مواد

2-3-1 تحریک تخمکگذاری و جفت اندازی124 موشها
پس از تحریک تخمکگذاری مطابق 3-2-2-1، موشهای ماده به نسبت 1:1 با موشهای نر 12-10 هفتهای، جفت انداخته شدند. صبح روز بعد، موشهای دارای پلاک واژنی125 از سایرین جدا گشتند.

2-3-2 آمادهسازی محیط و قطرهها
برای استحصال رویان، از محیطهای M2 و KSOM استفاده گردید. تهیه و قطرهگذاری این محیطها، مشابه بخشهای 3-2-2-2 و 3-2-4-1 صورت گرفت. همچنین به ازای هر موش، l 800 محیط M2 در میکروتیوپهایی با حجم ml 2 ریخته شد. این میکروتیوبها حداقل به مدت 4 ساعت و تا زمان استحصال رویان، درون انکوباتور با دمای C 37، رطوبت 97% و CO2 به میزان 5% نگهداری شدند.
2-3-3 جابجایی مهرهی گردنی
موشهای باردار، 3 روز پس از بررسی پلاک واژنی، به روش جابجایی مهرهی گردنی، مطابق 3-2-1-2 کشته شدند.

2-3-4 تشریح موش ماده و جداسازی لولههای رحمی
تشر
یح موش ماده، مطابق 3-2-2-4 صورت پذیرفت و بافت چربی و پردهی مزومتریوم اطراف لولهی رحمی حذف گشت. با ایجاد دو برش در زیر لولهی تخمبر و انتهای دو شاخ رحم (شکل ‏214)، این ناحیه از سایر نواحی جدا گردید.

شکل ‏214: جداسازی لولههای رحمی. محل برش با خطوط سیاه نشان داده شده

2-3-5 استحصال بلاستوسیست
در ابتدا یک قطرهی یl 250 از محیط M2 که با شرایط انکوباتور تنظیم شده بود، در پتری دیش mm 35×10 گذاشته شد. سپس ابتدای لولهی رحمی با پنس ظریف ثابت و حدود l 400 محیط M2 ، به وسیله سرنگ انسولین به داخل مجرای لولهی رحمی تزریق گردید (شکل ‏215). به واسطهی حرکت محیط M2، بلاستوسیستها از درون مجرای رحمی شسته و همراه با محیط از انتهای آن خارج و به درون قطرهی یl 250 ریخته شدند.
سپس بلاستوسیستها، به وسیلهی پیپت پاستور و در زیر استرئومیکروسکوپ، از قطرهی استحصال بلاستوسیست برداشته و پس از شستوشو در پتری دیشهای حاوی محیط M2 و KSOM، به پلیت چهار حفرهای منتقل شدند. تمام این مراحل، بر روی صفحهی گرم کننده با دمای یC 37 صورت پذیرفت. در نهایت پلیت مورد نظر درون انکوباتور با دمای C 37، رطوبت 97% و CO2 به میزان 5% قرار گرفت.

شکل ‏215: استحصال بلاستوسیست، از لولهی رحمی

2-4 سوراخ کردن مصنوعی126 بلاستوسیست
به منظور سوراخ کردن مصنوعی، از دستگاه ریز دستکاری127 (Narishige, 10291, Japan) دارای سیستم نگهدارنده128 (Eppendorf, 930001261) و تزریقی129 (Eppendorf, 930001066)، که به میکروسکوپ معکوس130 (Nikon, TI-U, Japan) مجهز به صفحهی گرم کننده (Nikon, TI-SR, Japan) متصل بود، استفاده گردید.

2-4-1 آمادهسازی محیط و قطرهها
در این مرحله، محیط M2مورد استفاده قرار گرفت. از این محیط قطرههایی با حجم هl 5 درون درب پتری دیش mm 35×10 گذاشته و با روغن معدنی استریل پوشانده شد (شکل ‏216). پتری دیش حداقل به مدت 4 ساعت درون انکوباتور با دمای C 37، رطوبت 97% و CO2 به میزان 5% قرار گرفت.

شکل ‏216: پتری دیش ریز دستکاری

2-4-2 آمادهسازی و تنظیم دستگاه ریز دستکاری
قبل از شروع کار، پیپت نگهدارنده131 با قطر داخلی m 25 و قطر خارجی m 110 (930001261, Eppendorf)، بر روی بازوی نگهدارنده و میکروپیپت تزریق کننده132 با قطر داخلی m 4 و قطر خارجی m 7 (930001066, Eppendorf)، بر روی بازوی تزریق، نصب گردیدند. این دو میکروپیپت به صورتی در مقابل هم قرار گرفتند که انتهایی موازی با کف پتری دیش داشته باشند.

2-4-3 روش کار
پتری دیش ریز دستکاری حاوی بلاستوسیست، زیر میکروسکوپ معکوس و بر روی صفحهی گرم کننده با دمای یC 37 قرار گرفت. پس از ثابت کردن بلاستوسیست توسط پیپت نگهدارنده و قرار دادن ICM در موقعیت ساعت 6 یا 12، پیپت تزریقی به آرامی و با کمترین آسیب از بین سلولهای تروفواکتودرم وارد حفره بلاستوسل گردید و پس از چند ثانیه به عقب کشیده و از بلاستوسیست خارج شد (شکل ‏217). در نهایت بلاستوسیست از پیپت نگهدارنده آزاد گشت.

شکل ‏217: نحوهی سوراخ کردن حفرهی بلاستوسیست با استفاده از دستگاه ریز دستکاری (بزرگنمایی 400×). الف: ثابت کردن بلاستوسیست به کمک پیپت نگهدارنده ب: موقعیت پیپتهای نگهدارنده و تزریقی نسبت به هم ج: سوراخ کردن حفره بلاستوسل توسط پیپت تزریقی د: کاهش مایع بلاستوسل و چروک شدن بلاستوسیست

2-5 انجماد رویان133
تمامی مراحل انجماد، مطابق روش کار Kuwayama و با استفاده از کرایوتاپ134 (81111-81115, Kitazato) انجام گرفت (Kuwayama et al., 2005c).

2-5-1 انجماد شیشهای
2-5-1-1 آمادهسازی محیط و قطرهها
محلولهای انجماد (جدول ‏21) حداقل یک ساعت قبل از شروع کار، در دمای اتاق135 ( C 27-25) قرار گرفتند. سپس دو قطره از محلول شستوشو136، سه قطره از محلول متعادلسازی137 و 4 قطره از محلول انجماد138 با حجم تقریبی بl 25، مطابق شکل ‏218 در پتری دیش mm 60×15 گذاشته شد.
جدول ‏21: محلولهای مورد نیاز برای انجماد شیشهای بلاستوسیست موش
محیط
ترکیبات
محلول شستو شو
TCM139(22340-020, Gibco) و 20% سرم جنین گاوی140 (10270, Gibco)
محلول متعادلسازی
TCM، 20% سرم جنین گاوی، 5/7% دی متیل سولفوکسید (D-2650, Sigma) و 5/7% اتیلنگلیکول (324558, Sigma)
محلول انجماد
TCM، 20% سرم جنین گاوی، 15% دی متیل سولفوکسید، 15% اتیلن گلیکول و ساکارز (S-9387, Sigma) M 5/0

مطلب مرتبط :   پایان نامه رایگان دربارهانتقال اطلاعات، درآمد سرانه، مصرف مواد، چرخه عمر

2-5-1-2 روش کار
بلاستوسیستهای دارای ظاهر طبیعی، پس از شستوشو در قطرهای 1 WSو 2 WSبه قطرهی 3WS منتقل شدند. در این مرحله، قطرهی 1ES توسط پیپت پاستور، به قطرهی 2WS متصل شد و بلاستوسیستها سه دقیقه در این حالت باقی ماندند.

شکل ‏218: نحوهی قطرهگذاری محلولهای انجماد شیشهای

سپس قطرهی 2ES نیز به این دو قطره متصل گشت. پس از گذشت سه دقیقه، بلاستوسیستها به قطرهی 3ES منتقل و به مدت نه دقیقه در این قطره قرار گرفتند. در مرحلهی بعد، رویانها طی یک دقیقه در قطرههای 1VS، 2VS، 3VS و 4VS شستوشو داده شدند و با کمترین حجم از محلولVS ، بر روی کرایوتاپ قرار گرفتند (شکل ‏219). کرایوتاپ به سرعت در نیتروژن مایع141 فرو برده شد و پس از قرار دادن سرپوش بر روی آن، به مخزن اصلی نیتروژن مایع منتقل گشت. تمامی مراحل انجماد شیشهای در دمای اتاق (اC 27-25) و زیر استرئومیکروسکوپ انجام گرفت.

شکل ‏219: موقعیت قرار گیری بلاستوسیست بر روی کرایوتاپ (بزرگنمایی 30×)

2-5-2 یخگشایی
2-5-2-1 آمادهسازی محیط و قطرات
محلولهای مورد نیاز مطابق جدول ‏22 آماده گردید. حداقل یک ساعت قبل از شروع فرایند یخگشایی، محلولهای شستوشو و رقیقسازی142 در دمای اتاق ( C 27-25) قرار گرفتند و ml 2/3 از محلول یخگشایی143 که در پتری دیش mm 35×10 ریخته شده بود (شکل ‏220 ال
ف)، به انکوباتور با دمای C 37، رطوبت 97% و CO2 به میزان 5% منتقل شد. پس از گذشت یک ساعت، دو قطره از محلول رقیقسازی و دو قطره از محلول شستوشو با حجم تقریبی وl 25، مطابق شکل ‏220 در پتری دیش mm 35×10 گذاشته شد. پلیت چهار حفرهای حاوی محیط KSOM نیز طبق 3-2-4-1 آماده گردید.

جدول ‏22: محلولهای مورد نیاز برای یخگشایی بلاستوسیست موش
محیط
ترکیبات
محلول یخگشایی
TCM،20% سرم جنین گاوی و ساکارز M 1
محلول رقیقسازی
TCM، 20% سرم جنین گاوی و ساکارز M 5/0
محلول شستوشو
TCM و 20% سرم جنین گاوی

2-5-2-2 روش کار
سرپوش کرایوتاپ حاوی بلاستوسیست، بدون اینکه از ازت مایع خارج شود برداشته شد. پتری دیش حاوی محلول TS در زیر استرئومیکروسکوپ دارای صفحه گرم کننده با دمای C 37 قرار گرفت. سپس کرایوتاپ به سرعت از ازت مایع به پتری دیش TS منتقل شد. بلاستوسیستها، طی یک دقیقه توسط پیپت پاستور، از روی کرایوتاپ برداشته شدند و به مدت سه دقیقه درون قطرات 1DS و 2DS و ده دقیقه درون قطرات 1WS و 2WS قرار گرفتند و شستوشو داده شدند. این دو مرحله در دمای اتاق (وC 27-25) انجام شد. در نهایت بلاستوسیستها به پلیت KSOM منتقل و درون انکوباتور با دمای C 37، رطوبت 97% و CO2 به میزان 5% نگهداری شدند.

شکل ‏220: الف) پتری دیش حاوی محلول یخگشایی ب) نحوهی قطرهگذاری محلولهای شستوشو و رقیقسازی

2-6 بررسی بیان ژن144
تمامی بررسیهای مولکولی، توسط مواد و وسایل عاری از آنزیمهای تجزیه کنندهی RNA145 و بر روی بلاستوسیستهای جمعآوری شده در مراحل قبل، صورت پذیرفت.

2-6-1 استخراج RNA از بلاستوسیست
برای استخراج RNA از بلاستوسیست، RNase Plus Micro Kit® (74034, Qiagen) مورد استفاده قرار گرفت. ابتدا میکروتیوب146 حاوی بلاستوسیست، به منظور جداسازی محیط KSOM، به مدت 5 دقیقه با شتاب g9167 سانتریفیوژ شد. سپس مایع رویی دور ریخته شد و فرایند استخراج RNA طبق مراحل زیر صورت پذیرفت.
1- µl 350 بافر تجزیه کنندهی RLT Plus به میکروتیوب حاوی بلاستوسیست اضافه گردید و میکروتیوب مورد نظر، به منظور ترکیب شدن مواد با یکدیگر، به مدت 1 دقیقه ورتکس شد.
2- محتویات میکروتیوب، بر روی فیلتر جدا کنندهی DNA ژنومی147 ریخته شد و به مدت 30 ثانیه با شرایط g 9167 سانتریفیوژ گردید.
3- µl 350 اتانول 70% به محلول عبور کرده از فیلتر افزوده و به خوبی با آن مخلوط شد.
4- مخلوط مورد نظر، بر روی فیلتر میکروتیوب Min Elute منتقل شد و به مدت 15 ثانیه با شرایط g 9167 سانتریفیوژ گردید.
5- پس از دور ریختن محلول عبور کرده از فیلتر، µl 700 بافر RW1، به منظور شستوشوی اجزای متصل به RNA، بر روی فیلتر ریخته شد و سانتریفیوژ به مدت 15 ثانیه با شرایط g 9167 انجام شد.
6- مجددا محلول عبور کرده از فیلتر دور ریخته شد. µl 500